人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养

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1、人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养作者：李富军，王雪萍，刘斌，李焰，李洁【Abstract】AIM：Topreparehighlypurifiedhumantrophoblastcellsfromhumanplacentaeatthefirsttrimesterofnormalpregnancyforfurtherstudyonthefunctionofhumanplacentaevilli.METHODS:AstandardtrypsinDNasedispersionmethodwasusedtoisola

2、tethetrophoblastcellsandcellpuritywasdeterminedbyimmunostainingformarkersoffibroblasts(antivimentin).Thestructuralfeatureswererevealedbytransmissionelectronmicroscopy.RESULTS:Thecellviabilityevaluatedbytrypanblueexclusionwasgreaterthan90%.Andlightmicroscop

3、icexaminationrevealedthatthecellswereepitheliallikecells,withpatchyspreading.Thecellswerepositiveforcytokeratinandnegativeforvimentin,indicatingtheabsenceofcontaminatingelements.Transmissionelectronmicroscopyrevealedthatthecellshadfinestructuralfeaturestyp

4、icaloftrophoblasts.CONCLUSION:Themethod,simpleandeasytooperate,canbeusedinstudyingthefunctionofhumanplacentaevilliduringpregnancy.　　【Keywords】trophoblast/cytology;cellculture;9persons　　【摘要】目的：培养纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞,为胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制研究提供细胞学基础.方法：胰蛋白酶DNase消化法培养人绒毛

5、膜滋养层细胞，间接免疫染色进行细胞纯度检测，透射电镜观察细胞内部结构.结果：倒置显微镜下，可见细胞为上皮样细胞形态，呈片状铺展生长.细胞角蛋白染色阳性，波型蛋白染色阴性，表明不含污染细胞.透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构.结论：该法简便易行，可获得合乎试验要求的人绒毛膜滋养层细胞.　　【关键词】滋养层/细胞学；细胞培养；人　　0引言9　　人胎盘绒毛膜滋养层细胞对研究胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制有很重要的生物学意义［1-8］.但由于在体研究受到各种因素的影响和限制，妨碍了对其功能的研究.体外培养

6、人绒毛膜滋养层细胞，由于不受复杂的内环境的影响，可在人为条件下对细胞进行多方面的研究.因而对研究其作用及机制提供了一种较好的试验手段.国内外有关人绒毛膜滋养层细胞的离体培养方法，大多步骤繁琐，成本很高，不适于普通试验室推广应用［2-4，6-11］.我们采用胰蛋白酶消化法分离培养人绒毛膜滋养层细胞，并用免疫细胞化学法和透射电镜对其进行鉴定，以寻求一种简便实用的培养方法.　　1材料和方法　　11材料　　DMEM培养基和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，DNaseI购自华美生物工程公司，HEPES购自Promeg

7、a公司，抗角蛋白IgG、抗波型蛋白IgG购自DAKO公司，超敏SP试剂盒购自福州迈新生物工程有限公司，超级小牛血清购自杭州四季青生物制品研究所，DHank，S液自配，所有液体均高压消毒或过滤除菌.6~10wk人工流产胎盘绒毛组织由第四军医大学西京医院妇产科门诊手术室提供.　　12方法　　121人绒毛膜滋养层细胞的培养取妊娠6~10wk、发育正常的流产新鲜胎盘组织，在无菌超净台内，用生理盐水冲洗3遍，去除血污，用眼科剪剪去蜕膜等物质，挑取绒毛组织，充分剪碎至糊状，用25mg/L胰蛋白酶液于37℃振荡消化20m

8、in，若发现上清黏稠，可再加DNase（150U/L）于37℃继续振荡消化10min，200目筛网过滤.将未消化完全的组织同法消化过滤后与第1次的滤液汇集，10009r/min离心10min，DMEM液洗3遍，加不含血清培养液，调整细胞数为8×108个/L，将细胞接种于培养瓶内，37℃、50mL/LCO2孵箱培养1h，镜下观察，见细胞部分贴壁，稍加振荡也不浮起时，收集附壁未牢的人绒毛膜滋养层细胞，1000r/mi