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1、人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养作者：李富军，王雪萍，刘斌，李焰，李洁【Abstract】AIM：Topreparehighlypurifiedhumantrophoblastcellsfromhumanplacentaeatthefirsttrimesterofnormalpregnancyforfurtherstudyonthefunctionofhumanplacentaevilli.METHODS:AstandardtrypsinDNasedispersionmethodinedbyimmunostainingformarkersoffibroblasts(antivimen
2、tin).Thestructuralfeaturesissionelectronmicroscopy.RESULTS:Thecellviabilityevaluatedbytrypanblueexclusionicroscopicexaminationrevealedthatthecellsentin,indicatingtheabsenceofcontaminatingelements.Transmissionelectronmicroscopyrevealedthatthecellshadfinestructuralfeaturestypicaloftrophoblasts.CO
3、NCLUSION:Themethod,simpleandeasytooperate,canbeusedinstudyingthefunctionofhumanplacentaevilliduringpregnancy. 【Keyega公司，抗角蛋白IgG、抗波型蛋白IgG购自DAKO公司，超敏SP试剂盒购自福州迈新生物工程有限公司，超级小牛血清购自杭州四季青生物制品研究所，DHank，S液自配，所有液体均高压消毒或过滤除菌.6~10g/L胰蛋白酶液于37℃振荡消化20min，若发现上清黏稠，可再加DNase（150U/L）于37℃继续振荡消化10min，200目筛网过滤.将未消化完
4、全的组织同法消化过滤后与第1次的滤液汇集，1000r/min离心10min，DMEM液洗3遍，加不含血清培养液，调整细胞数为8×108个/L，将细胞接种于培养瓶内，37℃、50mL/LCO2孵箱培养1h，镜下观察，见细胞部分贴壁，稍加振荡也不浮起时，收集附壁未牢的人绒毛膜滋养层细胞，1000r/min离心10min，加含150mL/L超级小牛血清的培养液，换瓶培养.当原代培养的细胞长满瓶壁的90%左右时进行传代,在倒置显微镜下直接观察细胞形态和生长状态并照相. 122人绒毛膜滋养层细胞的鉴定免疫细胞化学染色，取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种于预先放置有盖玻片的6孔培
5、养板中，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，PBS漂洗，纯丙酮固定15min，加过氧化酶阻断液,37℃,45min,PBS洗涤5min×3次，加非免疫性动物血清,37℃,45min,加入1∶75稀释的一抗,37℃,1h,4℃,24h,PBS洗涤5min×3次，加生物素化二抗，37℃孵育1h，PBS洗涤5min×3次，加链亲和素过氧化酶溶液,37℃,45min,PBS洗涤5min×3次,加DAB显色,镜下观察,5min左右终止显色,梯度乙醇脱水，二甲苯透明,中性树胶封片，显微镜下观察并照相. 123透射电镜观察选用生长良好细胞，常规将细胞消化，移入Eppendorf管中，1000r/mi
6、n离心10min.加40g/L戊二醛固定4℃过夜.10g/L四氧化锇后固定2h，50～100mL/L梯度乙醇脱水，树脂浸透及包埋，60℃聚合48h.饱和醋酸铀染色10min，枸橼酸铅染色10min，透射电镜观察. 2结果 21细胞形态学倒置显微镜下可见均匀分布的人绒毛膜滋养层细胞呈不规则多角形，核大卵圆形，位于胞质近中央，胞浆丰富透明.细胞为上皮样细胞形态，呈片状铺展生长.台盼兰排斥试验检测，细胞活力良好，存活率超过90%. 22免疫细胞化学染色角蛋白染色阳性率超过95%(Fig1)，波型蛋白染色阳性率低于2%（Fig2）,表明培养的人绒毛膜滋养层细胞纯度超过95%，可以满足后
7、续试验的需要. 23透射电镜观察透射电镜下可见细胞外有大量微绒毛，偶见包被陷窝，胞质中线粒体大而多，粗面内质网与糖原颗粒清晰可辩，还可见到电子密度高的脂滴（Fig3）. 3讨论 胎盘绒毛组织中含有多种细胞成分，包括滋养层细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、Hofbauer细胞及血细胞等.如何排除间质细胞等其它细胞成分而保留所需成分是培养成功的关键.不同的分离方法所获得的滋养层细胞纯度从40%至90%不等.角蛋白是构成上皮细胞骨架蛋白，波型蛋白是内皮细胞及
