异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导molt4细胞凋亡的研究

《异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导molt4细胞凋亡的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导Molt4细胞凋亡的研究作者：马旭东，黄轶群，郑瑞玑【摘要】目的研究异硫氰酸苯己酯（PHI）对淋巴母细胞性白血病Molt4细胞组蛋白乙酰化调控及诱导细胞凋亡的影响。方法采用MTT法观察PHI对Molt4细胞增殖的影响；流式细胞术观察细胞凋亡；WesternBlot观察PHI作用细胞后组蛋白H3（H3K9，H3K14）、H4（H4K5，H4K8，H4K12，H4K16）乙酰化状态变化及凋亡相关蛋白Bcl2、Caspase9、Caspase8、Caspase3、凋亡底物PARP表达的变化。结

2、果PHI可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡；PHI可使线粒体膜蛋白Bcl2，Caspase9及下游Caspase3，凋亡底物PARP表达下降，呈时效及量效关系；而Caspase8未见明显变化。PHI可增加组蛋白H3，H4乙酰化表达。结论PHI是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，调控组蛋白乙酰化水平，影响其表观遗传学，可抑制肿瘤细胞增殖，通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡,是一种潜在的抗肿瘤新药。【关键词】异硫氰酸盐类；组蛋白类；乙酰化作用；基因表达调控;细胞凋亡；白血病,淋巴细胞　流行病学调查显示，大量食用十字花科植物如椰菜、甘蓝和水芹菜等可以

3、降低肿瘤发生的风险[1102]。人们通过研究发现，十字花科植物中含有天然异硫氰酸酯化合物(ITCs)，它们以硫配糖体前体形式广泛存在[3]。迄今人们已经对20多种天然或合成的ITCs进行了研究，发现它们均具有不同程度的防癌抗癌作用。异硫氰酸苯己酯（PhenyhexyleIsothiocyanates,PHI）是一类人工合成的异硫氰酸衍生物。笔者前期的工作已经证明PHI可抑制组蛋白去乙酰化酶活性及其蛋白的表达，并调控HL60细胞的组蛋白乙酰化及甲基化，诱导HL60细胞凋亡[4]。本试验以淋巴母细胞性白血病Molt4细胞株为模型，研究P

4、HI诱导淋巴细胞系白血病细胞凋亡及其机制。1材料和方法1.1材料PHI（美国LKTLaboratories公司，批号：243－264），以75%甲醇配成5mmol/L存储液。细胞培养用1640（美国Gibico公司）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）；AnnexinV和PI双染试剂盒（美国BD公司）；Bcl2、Caspase3、Caspase9、Caspase8鼠单克隆抗体，PARP、βactin兔多克隆抗体，辣根过氧化物标记的羊抗鼠、羊抗兔的二抗，WesternBlot化学发光工作液（美国SantaCruz公司）；Anti

5、acetylHistoneH3（抗H3K9，H3K14）、AntiacetylHistoneH4（抗H4K5，H4K8，H4K12，H4K16）兔多克隆抗体（美国Upsate公司）；酶标仪（Fax2100,美国Stat公司）101.2方法1.2.1细胞培养Molt4细胞株（武汉大学典型物培养中心），用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液置37℃、体积分数为0.05饱和湿度的CO2培养箱培养，隔天换液传代培养，实验时取对数生长期细胞。1.2.2PHI对Molt4细胞增殖的影响取对数生长期细胞，将其浓度调整为1.0×105

6、mL-1接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，对照组使用75%甲醇，实验组分别加入PHI使终浓度为0,5,10,20,40μmol/L，每组设6个平行孔，培养24,48,72,96h后，每孔加入MTT（5mg/mL）10μL，继续培养4h，离心后小心吸去上清，每孔加100μLDMSO，充分震荡混匀，在酶标仪用双波长492nm和630nm测吸光度（D值），计算细胞增殖率：细胞增殖率（%）=（D实验-D空白）/（D对照－D空白）×100%实验重复3次。1.2.3PHI对Molt4细胞凋亡的影响用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基接

7、种于75mL培养瓶，每瓶接种2×106细胞，细胞浓度为2×105mL-1，加入PHI使终浓度为0,5,20,40μ10mol/L，作用3,7,14h后收集处理后细胞。按试剂盒说明书操作后，立即行流式细胞术检测。1.2.4PHI对Molt4细胞组蛋白乙酰化、凋亡相关蛋白影响细胞接种浓度及处理同前，收集细胞后，预冷PBS0.06mol/L洗涤2次，吸干洗涤液。按每1×106细胞加入100μL裂解液+1μL酶抑制剂的比例冰上裂解细胞30min，1000r/min4℃离心10min，吸取中间清亮层。Bradford法进行蛋白定量。以10％或1

8、2％的SDSPAGE电泳分离，半干电转移法转膜，室温下摇床封闭1h，加入用TBS根据不同的一抗稀释不同的浓度，4℃过夜，TBS洗涤液洗膜后分别放入用TBS按1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗