异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导Molt4细胞凋亡的研究

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1、异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导Molt4细胞凋亡的研究作者：马旭东，黄轶群，郑瑞玑【摘要】目的研究异硫氰酸苯己酯对淋巴母细胞性白血病Molt4细胞组蛋白乙酰化调控及诱导细胞凋亡的影响。方法采用MTT法观察PHI对Molt4细胞增殖的影响；流式细胞术观察细胞凋亡；WesternBlot观察PHI作用细胞后组蛋白H3、H4乙酰化状态变化及凋亡相关蛋白Bcl2、Caspase9、Caspase8、Caspase3、凋亡底物PARP表达的变化。结果PHI可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡；PHI可使线粒体膜蛋白Bcl2，Caspase9及下游C

2、aspase3，凋亡底物PARP表达下降，呈时效及量效关系；而Caspase8未见明显变化。PHI可增加组蛋白H3，H4乙酰化表达。结论PHI是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，调控组蛋白乙酰化水平，影响其表观遗传学，可抑制肿瘤细胞增殖，通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡,是一种潜在的抗肿瘤新药。【关键词】异硫氰酸盐类；组蛋白类；乙酰化作用；基因表达调控;细胞凋亡；白血病,淋巴细胞流行病学调查显示，大量食用十字花科植物如椰菜、甘蓝和水芹菜等可以降低肿瘤发生的风险[12]。人们通过研究发现，十字花科植物中含有天然异硫氰酸酯化合物(ITCs)，它们以硫配糖体前体

3、形式广泛存在[3]。迄今人们已经对20多种天然或合成的ITCs进行了研究，发现它们均具有不同程度的防癌抗癌作用。异硫氰酸苯己酯是一类人工合成的异硫氰酸衍生物。笔者前期的工作已经证明PHI可抑制组蛋白去乙酰化酶活性及其蛋白的表达，并调控HL60细胞的组蛋白乙酰化及甲基化，诱导HL60细胞凋亡[4]。本试验以淋巴母细胞性白血病Molt4细胞株为模型，研究PHI诱导淋巴细胞系白血病细胞凋亡及其机制。1材料和方法材料PHI，以75%甲醇配成mmol/L存储液。细胞培养用1640；胎牛血清；AnnexinV和PI双染试剂盒；Bcl2、Caspase3、Cas

4、pase9、Caspase8鼠单克隆抗体，PARP、βactin兔多克隆抗体，辣根过氧化物标记的羊抗鼠、羊抗兔的二抗，WesternBlot化学发光工作液；AntiacetylHistoneH3、AntiacetylHistoneH4兔多克隆抗体；酶标仪方法细胞培养Molt4细胞株，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液置3℃、体积分数为饱和湿度的CO2培养箱培养，隔天换液传代培养，实验时取对数生长期细胞。PHI对Molt4细胞增殖的影响取对数生长期细胞，将其浓度调整为×10mL-1接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，对照组使用

5、75%甲醇，实验组分别加入PHI使终浓度为0,5,10,20,40μmol/L，每组设6个平行孔，培养24,48,72,9h后，每孔加入MTT10μL，继续培养h，离心后小心吸去上清，每孔加100μLDMSO，充分震荡混匀，在酶标仪用双波长49nm和630nm测吸光度，计算细胞增殖率：细胞增殖率=/×100%实验重复3次。PHI对Molt4细胞凋亡的影响用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基接种于7mL培养瓶，每瓶接种2×106细胞，细胞浓度为2×10mL-1，加入PHI使终浓度为0,5,20,40μmol/L，作用3,7,1h后收集处理后细胞。按

6、试剂盒说明书操作后，立即行流式细胞术检测。PHI对Molt4细胞组蛋白乙酰化、凋亡相关蛋白影响细胞接种浓度及处理同前，收集细胞后，预冷PBS/L洗涤2次，吸干洗涤液。按每1×10细胞加入100μL裂解液+1μL酶抑制剂的比例冰上裂解细胞30min，1000r/min℃离心10min，吸取中间清亮层。Bradford法进行蛋白定量。以10％或12％的SDSPAGE电泳分离，半干电转移法转膜，室温下摇床封闭1h，加入用TBS根据不同的一抗稀释不同的浓度，℃过夜，TBS洗涤液洗膜后分别放入用TBS按1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗以及羊抗鼠

7、二抗，室温下摇床作用1h，TBS洗涤液洗膜后化学发光法显色，X射线底片曝光，以βactin为内参照，X射线胶片扫描后，AlphaDigiDoc图像分析软件进行分析比较。统计学处理SPSS软件处理数据。常规进行方差齐性检验，正态性检验。计量资料实验数据以x±s表示。多组资料之间的比较采用单因素方差分析；方差不齐采用非参数检验。以P结果.1PHI对Molt4细胞的增殖有抑制作用不同浓度PHI作用后，Molt4细胞的增殖率随药物浓度的增加及时间的延长而逐渐下降，表现为明显的浓度和时间依赖性。0,5,20,40μmol/LPHI作用后，Molt4细胞的增

8、殖率随药物浓度的增加而逐渐下降，表现为明显的浓度依赖性；20μmol/LPHI作