组蛋白修饰因子carm1调控人胚胎干细胞多能性分子机制的研究

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1、组蛋白修饰因子CARMl调控人胚胎干细胞多能性分子机制的研究摘要研究背景和目的人胚胎干细胞(hESC)是从人类早期胚胎内细胞团(ICM)分离出来的高度未分化的多能性细胞，具有无限增殖的能力，并经诱导可分化为不同类型的组织细胞。因此，人胚胎干细胞可作为理想的实验材料而用于医学、生物学、药学等方面的研究。目前认为与维持hESC分化潜能相关的转录因子是Oct4、Nanog和Sox2，对这组转录因子上游调控信号通路的研究目前主要集中于1GF、FGF受体以及TGFp通路的研究，表观遗传调控通路的研究鲜有报道。2007年Nature杂志报道，有研究者通过向早

2、期鼠胚(2-4细胞期)卵裂球显微注射共刺激因子相关精氨酸甲基转移酶1(CARMl)后，卵裂球内染色体的组蛋白甲基化水平升高，同时使卵裂球核gJNanog的水平显著升高，最终导致卵裂球向ICM分化。组蛋白修饰在hESC自我更新和分化中起着举足轻重的作用。组蛋白赖氨酸甲基化已被证明与hESC多能性维持以及体细胞的重编有关，而对组蛋白精氨酸甲基化相应的研究却是一片空白。CARMl作为一种组蛋白精氨酸甲基转移酶，其催化的位点包括组蛋白H3N端的17、26位以及C端的128、129、131、134位精氨酸(H3R17，26，128，129，131，134)

3、，对转录有直接调节作用的位点分别是H3R17和26。最近人们还找到了CARMl的特异性抑制剂，这为CARMl的功能研究提供有利条件。MicmRNAs(miRNAs)是一段包含l8-22bp长度的RNA分予，在体内也可以接受各种信号转导通路和转录因予变化的调控，通过碱基互补与靶mRNA部分或者完全结合，诱导靶mRNA的切割或者翻译抑制，调控基因的表达。已有研究者筛选出了在ESCs中特异性表达的miRNAs，最近的研究还发现上百条miRNAs在hESC分化前后出现了显著的表达差异。本实验发现共刺激因子相关精氨酸甲基转移酶1(CARMl)不仅能影响早期

4、鼠胚细胞qUNanog的表达水平，还能影nNhESCdONanog的表达。同时运用生物信息学的方法，我们预测了靶向CARMl的12条miRNAs，并最终证明MicroRNAl81家族能直接靶向CARMl，调控其在hESC中的表达。综上所述，本研究证明了CARMl在维持hESC多能性过程中扮演重要作用，揭示了组蛋白甲基化修饰、microRNA转录后调控协调参与至OhESC的多能性调控网络中的方式和机制，为hESC多能性调控找到一条全新的表观修饰通路。第二军医大学硕士学位论文第一部分：CARMl对早期鼠胚细胞和hESC多能性的影响方法：(1)CARM

5、lmRNA的合成以及重组质粒pcDNA3．1．flag一一CARMl的构建：通过PCR获得CARMI全长模板，使用mRNA体外合成试剂盒合成CARMlmRNA。将CARMl全长片段连接A,pcDNA3．1．flag一载体中，获得pcDNA3．1一flag一-CARMl真核表达载体。(2)早期鼠胚中CARMl过表达模型和hESC中CARMl过表达模型、knock．down模型的建立以及分析：通过显微注射系统将CARMlmRNA注射入二细胞期鼠胚的其中一个细胞。利用脂质体将pcDNA3．1-flag一．CARMl质粒转染入hESC中。设计CARMI特

6、异性siRNA，利用脂质体转染入hESC中，构建CARMl的knock．down模型。分别通过免疫荧光法和Realtime．PCR法、Westernblot法等检测各模型中Nanog等转录因子的表达情况，利用Realtime．PCR法检测CARMl的knock．down模型中三胚层分化Marker的表达情况，利用碱性磷酸酶(AP)染色比较CARMlknock．down组与对照组之问hESC的形态差异。(3)CARMl对hESC诱导分化后的形态变化的影响：通过撤除培养基中的bFGF诱导hESC分化，利用碱性磷酸酶(AP)染色比较CARMI过表达组与

7、对照组之间hESC的形态差异，结果：(1)CARMlmRNA长度在2000nt以上，与预计长度相同。pcDNA3．1．flag一．CARMl重组质粒测序鉴定，与CARMl序列完全匹配。(2)CARMlmRNA注射入早期二细胞期鼠胚其中一个细胞，发育至四细胞期后的注射组细胞Nanog水平上调。hESC中过表达CARMl后，Nanog水平和对照组比较显著升高。Knock．downCARM1后，Nanog水平和对照组比较显著下调，三胚层分化Marker的表达水平显著上调。CARMlknock．down组与对照组比较克隆形成数减少，形态减小，AP染色阳性

8、克隆显著减少。(3)CARMl过表达组与对照组相比，能在一定时间内维持hESC克隆的形态与数量。结论：f1)CARMImRNA的合成以及