db37t3126-2018禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范

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1、ICS11.220B41111DB37方标准DB37/T3126—2018禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范TechnicalGuidelineofImmunofluorescentTestofBordetellaavium2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局发布本标准按照GB/T1.1-2009给岀的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准由山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制屮心负责起草。本标准主要起草人：朱瑞良、胡莉萍、魏凯、黄河、杨萍萍、孙振红、彭军、张华杰、万吉国。

2、禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范1范围本规范规定了禽波氏杆菌病间接免疫荧光检测技术的试剂或材料、仪器设备、禽波氏杆菌外膜蛋白（0MP）的提収、禽波氏杆菌0MP含量测定、禽波氏杆菌外膜蛋白（0MP）抗血清的制备、阴性血清制备、禽波氏杆菌免疫荧光检测方法和判定标准。木规范适用于山东省境内从事家禽饲养以及从事家禽防疫活动的单位和个人禽波氏杆菌检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T603化学试剂试验方法屮所用制剂及

3、制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1蛋白定量Bradford法Bradfordmethodforproteinquantitation考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质一色素结合物在595nni波长下有最大光吸收，英光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，

4、反应灵敏，可测定微克级蛋白质含量。3.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-poIyacryIamidegeIeIectrophoresis,SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS,即十二烷基硫酸钠）后，蛋口质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素），可以用于分离蛋白质和寡核背酸。3.3免疫荧光试验immunofIuorescencetest是

5、在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。4试剂或材料4.1禽波氏杆菌禽波氏杆菌P5株，购自屮国兽医药品监察所。4.2抗体异硫鼠酸荧光素（FTTC）标记羊抗兔TgG。4.3生化试剂邻苯二胺（0PD）、聚乙二醇辛基苯基讎（Tri-tonX-100）、考马斯亮兰G-250、牛血清白蛋白（BSA）、不完全弗氏佐剂、丙酮（分析纯）、乙醇（分析纯）、廿油（分析纯）。5仪器设备5.1超净工作台。5.2恒温培养箱。5

6、.3超速冷冻离心机。5.4蛋白电泳仪。5.5微量移液器（20此〜100gL）o5.6电子天平。5.7超声波破碎仪。5.8旋涡混合器。5.9分光光度计（380nm〜780nm）。5.10荧光显微镜。6禽波氏杆菌外膜蛋白（0MP）的提取6.1将保存的禽波氏杆菌株接种于200mL肉汤培养基中，37°C振荡培养过夜后，离心收集过夜培养的细菌。肉汤培养基配制按附录A执行。6.2用10倍体积的含有10mMMgCl2的Tris-HCl（100mMpH7.8）缓冲液悬浮,超声波破碎（功率为500W、破碎时间60s、间隙60s、反复破碎10次）。Tris-HCl缓冲液配

7、制按附录A执行。6.3通过lOOOxg低速离心去除细胞核，上清液高速离心，10000代，20min。6.4含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含2%TritonX-100的Tris-MgCl2缓冲液溶解，室温下孵育30min降解内膜蛋白后，再进行lOOOOOxg,30min超速离心。6.5沉淀用缓冲液再悬浮，置-20°C保存备用。6.6SDS-PAGE电泳检测禽波氏杆菌外膜蛋白OMP的分子量。7禽波氏杆菌OMP含量测定7.1考马斯亮蓝法7.1.1取16支试管，1支作空白对照，3支用于检测禽波氏杆菌0MP样品，其余12支试管分为两组,每组6支，用于绘制标准曲线。

8、7.1.2用移液器向每组6支试管中各加入1.0mg/mL的标准蛋白质溶液各0.01ml八0.0