内毒素检测进展课件

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1、1第四军医大学西京医院检验科细菌室樊新内毒素检测进展及临床意义2内毒素（Endotoxin,ET）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，其化学成分为脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），由类脂A、核心寡聚糖O及多糖侧链组成。3一、内毒素的产生，作用机理及　　生物学效应内毒素的产生以往认为ET作为细胞壁的结构成分只有在菌体死亡或人工裂解时才能释放出来。但近年来发现革兰氏阴性杆菌在细菌对数生长期或细菌营养缺乏时也可以以“出疱疹”的方式被释放ET。4ET的入血途径肠道内毒素的吸收败血症时血中细

2、菌的释放外源性输入5内毒素的作用机理LPSLPS-LBP（LPS结合蛋白）LPS-SCO14（细胞膜上的受体）信号传递信号传递CD14+细胞（Mф，PMN，单核核细胞）CD14－细胞（上皮细胞等）吞噬作用杀菌活性一级介质释放粘附分子表达→细胞反应6TNF、IL-1IL-6、IL-8瀑布样反应，全身炎性反应综合症急性炎症PG、TXA、LTC、PAG、C5a、O2-、NO，弹力酶（二级介质）脓毒综合征（发热、低温、心动过速、尿少、酸中毒、低血压）DIC内毒素休克MOSF（多器官功能衰竭）死　亡7内毒素的生物

3、学效应发热反应白细胞反应内毒素血症（ETM）与内毒素休克（ETS）弥漫性血管内凝血（DIC）8二、内毒素的检测目前内毒素检测的方法主要有：鲎试验ELISA法结合免疫鲎试验法（IML）自动化动力学方法化学发光法光纤维生物传感法毛细管电泳法9鲎试验鲎试验（LT）检测LPS机理是LPS通过激活C、B因子、前凝固酶而使可凝蛋白变成凝固蛋白，形成肉眼可见的胶冻状物，通过比浊，对LPS进行半定量或定量检测。该法简单、无需特殊设备、耗费少、敏感性较好，可检测出0.01~1ng/ml的LPS，但易受多种因素的影响。10

4、①标本颜色的深浅可使敏感性偏低；②受血浆中LPS抑制因子的干扰；③非特异性凝血酶、凝血活酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等均可使鲎变形细胞溶解物产生假阳性反应；④LT法的标准化问题（目前国际尚无统一标准）。11ELISA法利用多粘菌素B﹑L－聚组氨酸及广谱交叉反应性的抗LPS－McAb与LPS有广泛的结合能力的特点，用其包被微量反应板，加入待检样品，再加抗LPS单克隆抗体（McAb），通过酶标二抗的显示来定量测定LPS，该法敏感性不高（0.5ng/ml），与LT法的相当,但定量准确性高于LT法。12结合免疫鲎试

5、验法（Immunolimulus,IML）以广泛交叉反应性抗LPS－McAb（Wn1222-5）来捕获LPS，再与鲎试剂反应，可定量检测样本中肠杆菌科细菌感染所释放的LPS，敏感性可达100pg/ml。该法以抗LPS单克隆抗体为探针使内毒素血症检测特异性得以改善，且不受标本浊度、放置时间、抑制因子等非特异性因素的影响，但仍不能避免鲎试剂自身因素的影响。13自动化动力学方法该方法先用KOH的复合碱试剂在微量反应板上对血浆标本进行预处理，以去除或灭活其中的干扰因子及酶抑制物，再直接加入对LPS高度特异的产色

6、鲎试剂（Endospecy），随后启动动态显色测定程序，检测仪自动绘制30min内的各孔反应曲线，根据标准曲线计算出样本中的LPS浓度。14该方法对LPS的定量范围为10~100pg/ml。反应中所用产色鲎试剂不含G因子，因此可避免与标本中存在的真菌发生凝固作用而出现非特异性反应，其优点还体现在标本先用碱处理，从而克服了鲎试剂内的一些影响因素。15化学发光法利用CR1和CR3受体诱导中性多核粒细胞中的氧化产物作为检测平台，依靠LPS－LPS抗体复合物使全血中的中性粒细胞所释放的氧化物质，引起补体调理酵母

7、多糖，导致发光物质（CL）氧化而发光，通过仪器光学系统检测发光的强度而定量测定血中的内毒素，对LPS定量范围为20~200pg/ml。该法对大多数革兰氏阴性杆菌的LPS有广泛的反应性，而对革兰氏阳性菌、曲霉菌等无反应，可望成为临床诊断内毒素血症的有用工具。16光纤维生物传感法利用短波光纤维生物传感器检测LPS，最低敏感性为10ng/ml，可在30s内完成。其原理是共价结合于光纤维探针表面上的多粘菌素B可选择性地结合荧光标记的LPS，未标记的LPS在竞争试验中根据已标记的LPS产生的荧光强度得以定量检测。

8、此法不仅应用于临床而且还可应用于环境中LPS的检测，该法虽快速简便，但敏感性不如IML法和ELISA法。17毛细管电泳法LPS是缺乏有旋光力的基团，检测其未衍化的状态比较困难。硼酸盐可与LPS分子的二乙基结合使其旋光力增强，采用UV活性多粘菌素B与LPS形成复合物或荧光素异硫基氟酸盐标记LPS亦可达到目的。方法是将处理过的标本吸入毛细管，用标准磷酸盐缓冲液（100mg/ml）做电泳，6min内即可完成检测。此法敏感性为35pg/ml，但电泳