三氧化二砷诱导肝癌细胞系hepg

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1、三氧化二砷诱导肝癌细胞系HepG：朱传升　侯明　王金慎　王焱　徐文伟　董琳【摘要】　　目的：测定不同浓度三氧化二砷（As2O3）诱导前后HepG-2细胞自噬水平改变，并初步探讨机制。方法：常规细胞培养，按As2O3不同浓度分组；采用MDC染色，荧光显微镜观察自噬囊泡，流式细胞术检测其荧光强度；RT-PCR检测Bcl-2基因转录，免疫组织化学检测细胞Bcl-2蛋白阳性百分率，并分析同自噬的关系。结果：经不同浓度As2O3作用后，HepG-2细胞生长明显受到抑制；荧光显微镜可观察到自噬囊泡的出现；Bcl-2基因表达降低

2、；经相关性分析，HL-60细胞自噬水平与Bcl-2基因表达呈负相关。结论：As2O3可诱导HepG-2细胞自噬，v诱导HepG-2细胞自噬的机制可能与下调Bcl-2基因表达有关，自噬和凋亡存在交叉。【关键词】自噬　基因，Bcl-2　三氧化二砷　肝肿瘤　细胞　培养的　　StudyofHepG-2cells’autophagyinducedbyarsenictrioxideanditsmechanism【ABSTRACT】Objective:Toassessthelevelofautophagyanditsmechan

3、isminHepG-2cellsafterinductionicroscopeandfloetrybymonodansylcadaverin（MDC）staining.RT-PCRinetheBcl-2mRNAexpression.APAAPicroscope;Bcl-2geneexpressionayinduceHpG-2cellstoautophagiaanditsmainmechanisms·Cells,cultured　　三氧化二砷（As2O3）作为一种抗肿瘤药物，主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡。关于As2O3

4、是否可诱导肿瘤细胞发生非凋亡形式的死亡（如自噬等），国内外报道较少。本研究通过观察不同浓度As2O3作用HepG-2细胞前后自噬水平的变化，初步探讨了其发生机制，总结报道如下。1　材料与方法1.1　主要试剂　单丹磺酰尸胺（MDC，货号30432）为美国sigma公司产品，临用前用PBS配制成0.05mmol/L；As2O31g/L（哈尔滨伊达药业产品），用前RPMI1640稀释成所需浓度；RT-PCR所用TapDNA聚合酶、dNTPs、RNA酶抑制剂等购自上海志壮生物有限公司；目的引物参照文献说明，由上海生工合成。

5、免疫组化试剂盒、鼠抗人Bcl-2单抗、羊抗小鼠lgG二抗均购自北京中杉金桥生物有限公司。1.2　细胞培养及分组　肝癌细胞株HepG-2由山东省千佛山医院普外科中心实验室传代培养。实验细胞以2×105ml-1接种于培养瓶中，培养液为10%胎牛血清的RPMI1640，置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱，行细胞爬片生长。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度As2O3处理。按As2O3浓度不同分为0（对照组）、1.0、2.0、4.0和8.0μmol/L5组；各组于处理24h后用0.25%胰蛋白酶消化，收获细胞或取出细胞爬片，进

6、行观察研究。1.3　一般形态观察　分别于加药前后倒置显微镜观察，并摄片。1.4　MDC荧光染色检测自噬自噬泡（autophagicvacuoles，AV）的染色：参考文献[1]，取出细胞爬片，PBS洗2次，除去含血清的培养基。用0.05mmol／LMDC于37℃温育60min后，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗2次，晾干后，使用荧光显微镜（Olympus）加356nm发射滤片和545nm断滤片进行观察和摄片。1.5　自噬的流式细胞术定量分析　以上述MDC染色方法染色，用Elite流式细胞仪（COULTER公司，

7、USA）以488nm激发波长，测定MDC染色的荧光强度。将光散射及荧光数据输入计算机分析得出结果。1.6　RT-PCR检测Bcl-2mRNA表达　37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养24h后，收集细胞，PBS洗2次。采用异硫氰酸胍一步法提取RNA，260/280nm测定其浓度和纯度；RT-PCR步骤参照逆转录酶试剂盒说明。Bcl-2引物序列:Sense5’￣TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG￣3’，Antisense5’￣TCACTTGTGGCTCAGATAGG￣3’，片段280bp；β￣action引物序

8、列：Sense5’￣GGGTCAGAAGGATTCCTGTG￣3’，Antisense5’￣GGTCTCAAACATGATCTGGG￣3’，片段317bp。PCR产物各20μl,在10g/L琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭染色,并在紫外灯下显影拍照。1.7　免疫组化法检测细胞Bcl-2蛋白阳性率　采用APAAP法，具体染色步骤参照试剂盒说明。阳性结果为胞质内出