黄芩苷诱导人肝癌hepg

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1、黄芩苷诱导人肝癌HepG【关键词】黄芩苷；人肝癌HepG-2细胞；细胞凋亡　　随着分子生物学的不断发展，人们对肿瘤的本质和作用机理方面有了更深层次的阐述，抗癌药物研究水平也不断提高。黄芩苷具有抗脂质氧化，降低血脂、血压和抗炎等药理作用［1，2］。本实验对黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及其相关蛋白表达进行了初步研究。现报道如下。　　1材料与仪器　　1.1细胞株HepG-2细胞购于南京凯基生物技术公司。　　1.2药物试剂黄芩苷购于南京青泽医药有限公司；噻唑兰购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自北京华美生物工程公司；胰蛋白酶购自美国

2、DIFCO公司；鼠抗bcl-2、bax及P53单克隆抗体购自福建迈新生物有限公司；免疫细胞化学试剂盒（S-P法）购自福建迈新生物有限公司。　　1.3仪器OLYMPUS倒置显微镜购自日本；RT-2100型酶标仪购自美国；二氧化碳培养箱购自日本HITACHI公司；超净工作台购自上海净化设备厂；PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自北京天地百年科技公司。　　2方法　　2.1HepG-2细胞培养人肝癌HepG-2细胞贴壁生长，培养于含10％灭活小牛血清，含100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、相对湿度90%、5%CO2培养箱内培养。　　2.

3、2MTT比色实验取对数生长期的细胞以每孔105个细胞接种于96孔细胞培养板，每孔培养液200μl，按照所需要的黄芩苷浓度（终浓度分别为：25，50，100μg/ml）接种于细胞培养板（瓶），每个药物浓度设4个平行复孔，与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，另设只加细胞不加药物的阴性对照组，继续培养24，48，72h后每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，继续培养4h后终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO150μl，振荡混合仪振荡10min，使结晶充分溶解，选择492nm波长酶标分析仪测定每孔光吸收值（A值），计算细胞生长抑制率。　　抑制率(%)=（对照孔A值

4、-实验孔A值）/对照孔A值×100%　　2.3免疫细胞化学染色法　　2.3.1爬片的制备取对数生长期的HepG-2细胞，调整细胞浓度，以1×105个/ml的浓度接种于放有多聚赖氨酸预处理的盖玻片的无菌6孔培养板，每孔2ml。在5%CO2饱和湿度环境下培养细胞24h，待细胞贴壁生长良好，吸除上清液，实验组加入黄芩苷，终浓度为50μg/ml，对照组加等量的生理盐水，继续培养48h后取出细胞爬片进行免疫细胞化学实验。　　2.3.2免疫细胞化学测定取出药物处理后的HepG-2细胞爬片，95%乙醇室温固定30min；3%H2O2-甲醇，室温孵育20min，消除内源性过氧化物酶活性；0.1

5、%Tritonx-100室温孵育30min，利于抗体进入细胞；10%正常山羊血清室温孵育20min，封闭非特异性抗原；倾去血清，加入50μl一抗，使其完全覆盖细胞，置于湿盒内，4℃过夜；加入50μl二抗，37℃，40min；加入50μl三抗，37℃，20min；DAB显色，显微镜下观察，至阳性显色明显时用自来水冲洗，逐级脱色、透明、中性树胶封片。　　2.3.3结果判断在高倍镜下，每例随机选取5个阳性细胞密度最高的部位，通过真彩色病理细胞图像分析系统，取其平均值作为凋亡相关基因蛋白的阳性表达率。　　2.4统计学处理使用SPSS11.5统计软件，完全随机分组实验所得数据的计量资料采

6、用t检验。完全随机分组实验所得数据的计数资料和率的比较采用χ2检验。　　3结果　　3.1MTT比色实验不同处理组分别培养24，48，72h，黄芩苷对HepG-2细胞生长有抑制作用，并且随着时间的延长和药物浓度的增加，黄芩苷对HepG-2细胞的抑制效果越明显，药物对肿瘤细胞生长有量-效、时-效关系。结果见表1～2。当黄芩苷浓度为50μg/ml，作用时间为48h时，对HepG-2细胞的抑制率为51.241%，接近半数抑制浓度(IC50)。故以后进行的所有实验中黄芩苷的终浓度为50μg/ml，作用时间48h为基准设定实验分组并观察各种结果。表1黄芩苷对肝癌HepG-2细胞的抑制作用，

7、表2黄芩苷对肝癌HepG-2细胞的抑制率(略)　　4讨论　　细胞凋亡的现象广泛存在于肿瘤的发生发展过程中，是细胞损伤的特征性病理生理变化，干预细胞凋亡来治疗肿瘤已成为当今肿瘤药理的一个新的发展方向。　　Bax自身形成同源二聚体。当细胞内Bcl-2较多时，Bcl-2和Bax的异源二聚体增多，凋亡趋势减弱：当细胞内Bax较多时，则Bax本身形成的同源二聚体占主导，易于发生凋亡。Bcl-2和Bax的基因产物相互作用，形成同二聚体或异二聚体，它们之间的比例影响着肿瘤细胞对各种凋亡刺激因子的敏感性和抗