糖尿病大鼠血管钙化的实验研究

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1、糖尿病大鼠血管钙化的实验研究血管钙化是动脉粥样硬化、肾病、衰老、高血压等多种疾病的病理生理基础［1-3］。血管钙化与动脉硬化斑块关系密切，氧化脂类物质和氧化应激引起的慢性炎症对血管钙化的发生、发展可能具有促进作用［4］。糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随着人民生活水平的提高，人口老龄化，生活方式的改变而迅速增加。糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素作用缺陷而引起。糖尿病人群中动脉粥样硬化的患病率较高，发病年龄较轻，病情进展也较快。国外报道在糖尿病病人体内存在冠状动脉钙化、瓣膜钙化以及其他部位的血管钙化，从而导致冠心病等

2、心血管疾病的发生，表明在高糖的环境中可以诱导细胞增殖和骨桥蛋白的表达［5］。但是糖尿病性大血管病变尤其是血管钙化间的关系目前未完全明了，糖尿病时发生血管钙化的确切机制也尚不清楚。本研究在大鼠血管钙化的模型上，观察糖尿病对血管钙化的影响，以探讨糖尿病与血管钙化间的关系及其可能机制。　　1材料与方法　　1.1材料雄性Sprague-Daa公司；维生素D3购自上海通用药材有限公司；大鼠骨钙素、TNF放免试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司；碱性磷酸酶测试盒购自南京建成生物技术有限公司；其余试剂均为市售分析纯。　　1.2实验分组及

3、大鼠模型的制备参照文献［6-7］方法制备大鼠血管钙化和糖尿病模型，取24只雄性SD大鼠(体重180～200g)，随机分为4组，每组6只。①钙化组(VDN)：维生素D3(300000IU/kg)肌肉注射，同时尼古丁(25mg/kg溶于花生油)灌胃，9h后尼古丁重复灌胃1次；②糖尿病组(DM)：将STZ溶解于0.1mol/L、pH4.5、无菌的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，制成浓度为12mg/mL(1.2％)的STZ液，腹腔注射STZ60mg/kg，72h后血糖值≥16.67mmol/L为DM大鼠［8］；③钙化＋糖尿病组(VDN+

4、DM，简称糖尿病干预组)：同时①②操作；④对照组(CON)：操作同①②，肌肉注射生理盐水和单纯花生油灌胃，腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。　　饲养室内通风良好，室温18～25℃，相对湿度40％～70％，每日12h光照维持，昼夜循环，饲养时间为9～11月份。自由摄食、饮水。定期称重(每3天1次)，钙化处理6周后乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉，心脏取血，肝素抗凝，分离血浆，-70℃冻存备用。摘取全长胸腹主动脉，取5mm升主动脉用10％中性福尔马林固定，用于组织学观察，其余部分作下述测定。　　1.3血管组织总钙含量测定［8］

5、　　取胸主动脉(约10mg)80℃烤干，加入2mol/L硝酸0.5mL，180℃消化并烤干，冷却后加入去离子水(含27nmol/L的氯化钾和27μmol/L的氯化镧)10mL复溶，取2mL加入1%氯化锶100μL，原子吸收分光光度计(Jena，novAA300)在422.7nm处读取吸光度，测定组织的钙含量(以μmol/g·dg胸主动脉，以等渗PBS制备组织匀浆，4℃8000×g离心10min，吸取上清液，以考马斯亮蓝法行蛋白定量。按照ALP测定试剂盒说明书，采用磷酸苯二钠(金氏)法测定ALP活性(用U/mg·pro表示)。

6、　　1.5血浆及血管组织骨钙素(OC)和肿瘤坏死因子(TNF)浓度测定　　主动脉用PBS匀浆离心后，按照试剂盒说明书，采用放射免疫法测定血浆及主动脉骨钙素的浓度(用ng/g·pro表示)和肿瘤坏死因子浓度(用ng/g·pro表示)。　　1.6VonKossa染色［8］　　血管组织进行石蜡包埋、切片，常规脱蜡、脱水后浸入5%的硝酸银溶液中，在日光下照射60min，再用2.5%的硫代硫酸钠溶液处理5min，然后依次用碱性品红复染，经脱水、透明、封固，在光镜下观察。　　1.7统计学方法　　数据以均值±标准差表示(±s)，两样本均数

7、间比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-an-Keuls(SNK)方法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1大鼠血管钙化特征　　血管VonKossa染色见钙化组血管，尤其是中膜弹性纤维间有大量黑色颗粒，沉积于细胞外基质和平滑肌细胞内，部分聚集成团并形成钙结节，表明存在钙沉积；正常组和糖尿病组血管未见黑色颗粒(图1，见封3)。钙化组大鼠主动脉ALP活性、OC浓度和钙含量分别较对照组高2.83倍、84.12％%和1.98倍；钙化组大鼠血浆ALP活性和OC浓度分别较对照组高1.90倍和93.02％(P均

8、＜0.01)，见表1。　　2.2糖尿病促进大鼠血管钙化作用　　与单纯钙化组相比较，糖尿病干预后大鼠血管中膜弹力纤维的黑色颗粒明显增多，大量钙结节形成，呈灶状分布，并有大量弹力纤维的断裂，表明明显增强了血管组织的钙沉积(图1)。与对照组相比，单纯糖尿病组大鼠血浆ALP活性和OC浓度分别高1.