体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞的分化

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1、体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞的分化骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一种具有多分化潜能的干细胞，在不同的培养条件下可分化为一系列的细胞类型。肺损伤体内实验研究表明，肺损伤小鼠移植MSCs后，MSCs可转化为肺泡Ⅱ型(typeⅡalveolarepithelialcell,AECⅡ)和Ⅰ型上皮细胞(typeⅠalveolarepithelialcell,AECI)等，以修复损伤肺组织[1]。ROJAS等[2]研究发现，在体外损伤肺组织分泌的因子可以诱导MS

2、Cs增殖并向损伤肺迁移，而正常肺组织细胞并没有此功能。POPOV等[3]采用MSCs与肺上皮细胞(A549)非接触共同培养，成功诱导MSCs向肺上皮细胞分化。本研究采用MSCs与肺组织单细胞悬液非接触共培养模型，观察能否在体外利用损伤肺组织诱导MSCs向肺泡上皮细胞分化,为进一步研究骨髓源性的间充质干细胞治疗肺损伤奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　出生4周的健康昆明小鼠，体重为10.0～11.5g，共25只，均为雄性(中国医学科学院实验动物中心提供)。DMEM完全培养基和标准胎牛血清(GIBCO公司，美

3、国)，胰蛋白酶(Sigma公司，美国)。TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)，RT-PCR试剂盒(QIAGEN，德国)。倒置显微镜(TE2000,Nikon公司，日本)，高分辨率成像系统(DXM1200C，尼康，日本)，激光共聚焦显微镜(C1-SHS，尼康公司，日本)，二氧化碳细胞培养箱(SKP-02B，湖北省黄石市恒丰医疗公司)，24孔板(HangingCellCultureInsertPET0.4μm，MILLPORE公司，德国)。　　1.2小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离、扩增和鉴定　　小

4、鼠颈椎脱臼处死后，放入750mL/L的酒精内浸泡5min。无菌条件下取出双侧股骨，去除附带组织，两端剪断暴露骨髓腔。用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液及1号针头反复冲洗，将骨髓腔内的骨髓冲出，并用1号针头反复抽吸，制成单细胞悬液，充分混匀，转入离心管，1500r/min离心5min弃上清及脂肪层，沉淀用DMEM培养液充分混匀，用吸管轻轻叠加到密度为1.077g/mL的Ficoll-Paque分离液上，2500r/min离心10min，取界面层的单核细胞，再用DMEM培养液多次洗涤，离心后备用。细胞沉淀以5

5、×105个/cm2密度接种于培养瓶，加入DMEM完全培养液置于37℃，50mL/LCO2，80%相对湿度的培养箱中，2d后全量换液，去除未贴壁的细胞，以后每隔3d换液1次，倒置相差显微镜逐日观察细胞的形态，贴壁情况及生长情况。待细胞融合达80%，胰酶37℃消化，进行传代、扩增培养。取培养第2代的细胞用PBS洗涤3次，胰酶消化成单细胞悬液，将细胞悬液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀PBS洗涤3次，分别加入荧光标记的抗体，4℃孵育30min，PBS洗去未标记抗体，10g/L多聚甲醛固定，应

6、用FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。　　1.3建立体外非接触共培养实验模型　　参照本实验室的方法建立小鼠肺损伤模型[4]，并参照POPOV等[3]方法建立体外非接触共培养实验模型，实验模型图见图1。无菌条件下分离提取无肺损伤肺组织(共25只小鼠)、肺损伤模型肺组织(共25只小鼠)。制备肺组织单细胞悬液。将约5×104个/mL的小鼠肺细胞接种于0.4μm孔径(Millpore)大小的膜上(悬挂式体外共培养小室)，并放入24孔板中，在24孔板的底部同时放上适当大小的载玻片，并接种约5×104个/mL小鼠骨

7、髓间充质干细胞(MSCs)。共设计三组，每组6孔：对照组：MSCs单独静置培养；实验组A：正常健康肺组织单细胞悬液(上室)+MSCs(下室)；实验组B：损伤组肺组织单细胞悬液(上室)+MSCs(下室)细胞。共同培养8d，每日倒置相差显微镜下观察细胞形态，贴壁情况及生长情况。　　　1.4激光共聚焦显微镜检测表面蛋白C(surfatcantproteinC,SP-)和水通道蛋白5(aquaporinprotein5,AQP-5)的荧光表达　　在共培养的第8天，根据以下步骤处理细胞标本：①将共培养中接种有MSCs的载玻

8、片取出，40g/L的多聚甲醛固定10min，0.01mol/LPBS漂洗3～5次；②在同一培养皿中分别加入PBS稀释抗-SP-C(1∶100)一抗和抗-AQP5(1∶100)，湿盒内4℃孵育24h，0.01mol/LPBS漂洗3次；③加入FITC标记和TRITC标记的抗兔IgG(1∶100)，37℃孵育2h，0.01mol/LPBS漂洗3次；④0.01mol/LPBS充分