大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞

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时间:2018-10-30

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1、大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞姜廷帅 蔡莉 惠延年 闫峰AbstractAIM:Toexploretheplasticityoftransdifferentiationofmesenchymalstemcells(MSC)intocornealepithelialcells.METHODS:MSCofadultratsthatentculturemethod.ThetransdifferentiationofMSCintocornealepithelialcellsalfibroblasts.Thee

2、xpressionofK12onMSCsmunofluorescentstaining.RESULTS:MSCculturedinvitroshoalfibroblastsforoneesenchymalstemcell;cornealepithelialcells;transdifferentiation摘要目的:探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC,经体外与角膜基质细胞共培

3、养诱导分化,免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达。结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能,原代培养的骨髓MSCCD29免疫荧光染色阳性,CD34和CD45为阴性,符合骨髓MSC的特征。MSC与角膜基质细胞共培养1esenchymalstemcell,MSC),在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞。我们对骨髓MSC向角膜上皮细胞的分化潜能做一些初步的探索,从而探讨骨髓MSC作为构建组织工程化角膜的种子细胞的可行性

4、。1材料和方法1.1材料PBS液(含青链霉素100kU/L);细胞培养基(DMEM/Ham’sF12,10mL/L胎牛血清);2.5g/L胰蛋白酶;中性蛋白酶dispaseⅡ;Percoll储存液(密度1077g/L);兔抗大鼠CD29,CD34,CD45mAb(美国Chemicon公司)、兔抗大鼠角蛋白K12mAb(美国SantaCruz公司),山羊抗兔FITC标记二抗(北京中山生物技术公司),跨室培养装置(Trans,美国Millipore公司)。1.2方法1.2.1大鼠骨髓MSC的分离培养取4L/L乙醇中浸泡10

5、min。无菌条件下用外科剪于大鼠的股骨端将大腿剪下,剪去胫骨,用眼科剪剪开皮肤,分离去除肌肉,剪去股骨两端的膨隆部分,暴露骨髓腔,用含肝素的PBS液冲洗骨髓腔,收集于培养皿,如此反复数次。在一无菌离心管中,加入Percoll液0.6mL和8.5g/LNaCl溶液0.4mL,混匀配制成密度为1077g/L的细胞密度梯度分离液。将收集的细胞悬液缓慢加在分离液的上部,2000r/min离心30min,去除上清。PBS洗2次,按2×108/L密度接种细胞于75mL塑料培养瓶中。接种48h后换液,以后每2~3d换液,观察细胞增殖

6、能力及形态学特征(倒置显微镜)。另将原代培养的MSC接种于盖玻片上,待细胞长出后,用PBS离心洗涤(1000r/min,5min)2次,把细胞片浸入950mL/L乙醇中固定。将已经固定的细胞玻片放入盖片染色缸,用PBS振洗5min,取出吹干。滴加滴度为1∶32~64的特异性抗体(一抗,CD29,CD34,CD45,K12),置于湿盒内,37℃保温孵育60min,另以PBS代替一抗作阴性对照。随后PBS振洗3次,吹干。滴加适当稀释的荧光素标记抗体(二抗,FITC标记的山羊抗兔IgG),置于湿盒内,37℃保温30min。P

7、BS振洗2次,然后用蒸馏水振洗1次。500mL/L缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察并照相记录。1.2.2角膜基质细胞的制备无菌条件下摘取大鼠眼球,沿角膜缘处分离出整个角膜,先用普通消化液浸泡,置于37℃30min,再用dispaseⅡ于37℃消化2~3h。消化后用PBS洗去消化下来的上皮细胞。在显微镜下观察,若发现细胞未消化干净,用眼科小镊子轻轻刮取细胞,确保角膜上皮细胞完全被消化下来。将角膜基质剪成1mm×1mm大小的组织块,放入离心管中加入4mL胶原酶,将离心管倾斜放入37℃孵箱内,每隔5min振摇一次,消化1h。

8、收集消化液,过100目不锈钢网过滤,800r/min离心,5min,去除上清,用PBS离心漂洗1~2次,去除上清,按1×107/L密度接种于25mL培养瓶中。1.2.3大鼠骨髓MSC与角膜基质细胞共培养按Millipore公司的说明,用Trans)装置进行大鼠骨髓间充质干细胞与角膜基质细胞的共培养。共培养体系中上、下层的细胞被隔开

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