巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶来源的no对共培养h

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1、巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶来源的NO对共培养H【摘要】目的研究巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的一氧化氮（NO）对共培养HL60细胞凋亡的影响。方法以脂多糖（LPS）和γ干扰素（INFγ）诱导RATT）试验、蛋白质印迹分析、荧光分析、流式细胞术（FCM）、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等分析技术，观察NO对共培养的HL60细胞存活率、bcl2和bax蛋白表达、Caspase3活性和细胞凋亡的影响。结果RAethodsUponstimulationacrophages,etry（FCM）,transmissionelectronmicrosco

2、py（TEM）andDNAagarosegelelectrophoresis.ResultsTheresultsshoageofHL60cellscoculturedacrophages,anddecreasedcellviability,andevidentlyreducedexpressionofbcl2andincreasedexpressionofbax,andinducedactivityofcaspase3andDNAfragmentation.ConclusionTheresultssuggestedimportanteffectofiNO

3、SderivednitricoxideonapoptosisofcellsinRAerck公司），兔抗bcl2、bax多抗（SantaCruz公司），增强化学发光检测试剂盒（Pierce公司），其余为国产分析纯试剂。　　1.2细胞的培养及处理将复苏的RAI1640培养基中，置5%CO2、37℃培养箱，待细胞生长至对数生长期时用于实验。实验前换成无血清的RPMI1640培养基，将RAlLPS和100U/mlIFNγ诱导）、LPS＋LNNA组（用终浓度为1μg/mlLPS和100U/mlIFNγ诱导，同时加入终浓度为400μmol/LLNNA）。　

4、　1.3RAW264.7细胞产生的NO的检测采用ESR自旋捕集技术检测RAW264.7细胞产生的NO。RARTPCR试剂盒进行RTPCR扩增以分析iNOS基因的转录水平，用GAPDH作为内参物。PCR引物设计参照文献[5]，由上海生工公司合成。iNOS引物序列：5′GTGTTCCACCAGGAGATGTTG3′/5′CTCCTGCCCACTGAGTTCGTC3′，扩增片段长度576bp；GAPDH引物序列：5′GAAGGGTGGGGCCAAAAG3′/5′GGATGCAGGGATGATGTTCT3′，扩增片段长度295bp。扩增产物经1.5

5、%琼脂糖凝胶电泳检测，并用UVP凝胶成像系统进行扫描分析。　　1.5共培养HL60细胞存活率的检测将分别诱导24h、12h、6h、0h的RAI1640培养基洗涤1次，然后各加入1×106个/mlHL60细胞悬液5ml，共培养24h，取上述各组中的HL60细胞悬液100μl分别加入96孔板的孔内（1×105个/孔），以未经过任何处理的HL60细胞（1×105个/孔）为对照，加入MTT(5mg/ml)10μl，37℃培养4h，加入100μl的裂解缓冲液（25%DMF、10%SDS、2.5%冰醋酸），37℃、5%CO2孵箱中孵育10min，紫色结晶完全溶解后，用酶

6、标仪检测各组细胞的570nm吸光度（A）值。　　1.6共培养HL60细胞bcl2、bax蛋白的检测RACA作为Caspase3底物，采用荧光法测定细胞凋亡过程中Caspase3活力的变化[6]。离心收集1.2×107个细胞，加入0.4ml匀浆缓冲液，冰浴匀浆破碎细胞，4℃12000r/min离心15min后收集上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。酶活力测定体系总体积为150μl，含有100μg蛋白提取物，荧光底物DEVDMCA的浓度为25μmol/L。37℃反应30min后用荧光酶标仪测定寡肽底物降解释放出的荧光物质，激发波长355nm，发射波长

7、460nm。Caspase3酶活力单位定义为在37℃、底物浓度饱和的条件下每分钟产生1pmolMCA。　　1.8共培养HL60细胞凋亡分析RA）观察细胞超微结构并照相。　　1.9共培养HL60细胞DNA片段分析RATT比色原理是利用活细胞线粒体脱氢酶能将MTT盐还原成蓝紫色的甲臢颗粒，以颗粒溶解后呈现的颜色深浅反映细胞活性。HL60细胞与诱导后的RATT盐还原成蓝紫色的甲臢减少。以未经过任何处理的HL60细胞存活率为100%，其他组细胞存活率见，见表1。表1内源性NO对共培养HL60细胞存活率的影响（略）注：n=6、±s、与对照组比较，*P＜0.05；与LP

8、S组比较，**P＜0.05　　2.4内