tnfαtumstatin融合基因腺病毒载体的

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1、TNFαTumstatin融合基因腺病毒载体的【摘要】构建携带绿色荧光蛋白的TNFαTumstatin融合基因腺病毒表达载体，转染人脐带间质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)。方法：设计含有GMCSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物，PCR扩增TNFαTumstatin，将扩增产物亚克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV上，重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183中同源重

2、组。筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒，酶切鉴定并测序。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞，经过包装、扩增后感染hUCMSCs并检测细胞内融合基因的表达。结果：重组腺病毒质粒经PCR和PacⅠ酶切鉴定，证实含有TNFαTumstatin融合基因，测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒感染的hUCMSCs表达绿色荧光蛋白和融合基因。结论：成功构建了TNFαTumstatin融合基因的腺病毒表达载体，能高效率感染hUCMSCs，为进一步研究融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤效应奠定了

3、基础。【关键词】腺病毒载体融合基因同源重组细胞转染［Abstract］Objective:Toconstructgreenfluorescenceprotein(GFP)labeledrebinantadenovirusvectorcarryingTNFαTumstatinfusiongeneandtransfectitintohUCMSCs.Methods：TheamplificationproductsofTNFαTumstatinbyPCRersidpAdtrackCMVafterdiges

4、tingid,afterlinearizedbydigestingeⅠ,edintoE.coli.BJ5183thathadbeentransformedbyadenoviralbackboneplasmidpAdEasy1.RebinantplasmidycinandthenconfirmedbyPCRandrestrictionendonucleaseanalysis.Theadenovirusanembryonalkidneycells(293Acells)afterbeinglinearize

5、dbydigestingeasthatofdesignedfragments.hUCMSCsinfectedbytherebinantadenovirusexpressedGFPandfusiongeneonstratedbyfluorescencemicroscopeandRTPCRrespectively.Conclusion：RebinantadenovirusvectorcontainingTNFαTumstatinhasbeenconstructedsuccessfullyandcould

6、transfectedhUCMSCsefficiently,oreffectofhUCMSCsmodifiedstatin.［Keyologousrebination;celltransfectionTNFα对肿瘤细胞有直接的毒性作用，对肿瘤血管也有一定的破坏效应。然而临床上使用TNFα存在抑制肿瘤效率低、剂量高和毒副作用强等问题。Tumstatin能抑制肿瘤血管新生来发挥抗肿瘤的效应。Luo等［1］构建的双功能融合蛋白TNFαTumstatin有望克服TNFα应用剂量高、毒副作用强的缺点，发挥二者联

7、合抗肿瘤作用。为此我们以TNFαTumstatin融合基因为目的基因，构建了绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein，GFP）标记的重组腺病毒表达载体，初步探讨其在人脐带间质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)中的表达，为开展融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤研究奠定实验基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株、质粒和细胞株E.coli.DH5α菌株，E.coli.BJ5183菌株为本室保存；PBV220TNF

8、αTumstatin由安徽省立医院检验科罗以勤等提供；pAdTrackCMV和pAdEasy1由南京师范大学生命科学院惠赠；人胚肾293A细胞株购自南京凯基科技发展有限公司。1.1.2主要试剂限制性核酸内切酶BglⅡ，HindⅢ，PmeⅠ，PacⅠ为Biolabs公司产品；T4DNA连接酶，LATaq酶，反转录试剂盒为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；胶回收试剂盒，磷酸钙转染试剂盒为Promega公司产品。1.