ghrelin 对mptp小鼠帕金森病模型黑质t

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　　Ghrelin对MPTP小鼠帕金森病模型黑质T【摘要】目的探讨Ghrelin对1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）造成的黑质（SN）多巴胺能神经元损伤的保护作用及可能机制。方法小鼠随机分为对照组、MPTP组和Ghrelin+MPTP组。腹腔注射MPTP制备帕金森病小鼠模型；Ghrelin+MPTP组于MPTP注射前，侧脑室微量注射Ghrelin200ng，共8d；对照组以等量生理盐水取代Ghrelin和MPTP。应用半定量RTPCR技术检测各组小鼠SN内酪氨酸羟化酶（TH）、Bcl2和BaxmRNA的表达情况。结果MPTP导致小鼠SN内THmRNA的表达明显低于对照组(F=34.77，q=11.91，P<0.01)，Ghrelin预处理小鼠SN内THmRNA表达量较MPTP组明显增加(q=5.05,P<0.01)。MPTP导致小鼠SN内Bcl2/Bax由对照组的1.13±0.03减少至0.47±0.06(F=111.59，q=17.58,P<0.01)，Ghrelin预处理小鼠Bcl2/Bax明显高于MPTP组(q=18.94,P<0.01)，可恢复至正常水平。结论Ghrelin预处理对于MPTP造成的TH基因表达量减少有改善作用，该作用可能通过抗凋亡途径实现。【关键词】Ghrelin帕金森病1甲基4苯基四氢吡啶酪氨酸单氧化酶细胞凋亡 ［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheeffectofGhrleinontyrosinehydroxylase(TH),Bcl2andBaxmRNAexpressionofthesubatantianigrain1methy4phenyl1,2,3,6tetrahydropyridine(MPTP)inducedmousemodelofParkinsondisease.MethodsEighteenhealthymaleC57BL/6mice：Control,MPTPandGhrelin+MPTP.ThemiceinMPTPgroupg/kg,i.p.),oncedailyforfivedays,alsaline.ThetotalmRNAofthesubstantianigra(SN)RNAexpressionofTH,Bcl2andBaxbysemiquantitivereversetranscriptionpolymerasechainreaction.ResultsparedRNAexpression(P<0.01).PretreatedRNAexpressionparedRNAexpressioninducedbyMPTP.Theantiapoptoticpathightbethemechanismofthisneuroprotectiveeffect.［KEYA等[2]于1999年发现的一种脑肠肽,由28个氨基酸组成，为生长激素促分泌素受体(GHSR)的内源性配体,有刺激食欲、促进摄食、减少能量消耗、增加体质量的作用。最近的研究表明，Ghrelin能够刺激多种细胞的增殖并能抑制凋亡。ZIGMAN等[3]利用组织原位杂交技术检测Ghrelin功能性受体——GHSR1amRNA在大小鼠脑内的分布，发现在SN的TH免疫阳性神经元上有GHS R1a的表达。为研究Ghrelin是否具有保护PD动物模型SN内DA能神经元的作用，本实验应用半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，对1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）制备的C57BL/6小鼠PD模型SN内酪氨酸羟化酶（TH）、Bcl2和BaxmRNA表达量进行了检测，对Ghrelin的神经保护作用及其可能的机制进行了初步探讨。1材料与方法1.1材料MPTP、Ghrelin（Sigma公司），TRIzol试剂（Gibico公司），逆转录试剂盒（Promega公司），TagDNA聚合酶以及DNAMarkerDL2000（TAKARA公司）。1.2动物分组选择健康雄性C57BL/6小鼠18只，8～10周龄，体质量（20±2）g，由北京维通利华实验动物有限公司提供,其合格证号为：scxk（京）20020003。置于（19±2）℃室温下，安静环境饲养，昼夜循环光照，自由饮水、取食。采用完全随机分组方法将小鼠分为对照组、MPTP组和Ghrelin+MPTP组共3组，每组6只。1.3单侧侧脑室埋管术术前所有小鼠禁食12h，以80g/L水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，充分暴露颅骨，参考GEORGE 等编著的《小鼠脑立体定位图谱》（2001）以三棱针于颅骨表面侧脑室代表区（前囟后0.3mm，矢状缝右侧1.0mm，颅骨表面下2.2mm）钻透颅骨。然后，将长7.0mm、外径0.7mm、内径0.5mm的不锈钢外套管置入右侧侧脑室，以502胶和牙托粉固定外套管，并置入针芯防止堵塞。术后恢复3d，分笼饲养，每天腹腔注射2万单位青霉素预防感染。1.4给药方法术后第4天开始，小鼠在无限制状态下给药。侧脑室给药每天9：00时进行，共持续8d，注药深度为2.5mm，注射时间为2min，停针2min。自第4天侧脑室给药起，每天于11：00时腹腔注射MPTP（30mg/kg），共5d[4]。①对照组：接受与另两组相同的处理，药物以等量生理盐水代替；②MPTP组：侧脑室注射生理盐水2μL，腹腔注射MPTP；③Ghrelin+MPTP组：首先侧脑室注射Ghrelin200ng（2μL），然后腹腔注射MPTP。每次给药后均仔细观察小鼠行为的表现。1.5半定量RTPCR小鼠于末次给药24h后颈椎脱臼处死，迅速断头取脑，于冰上分离出中脑SN部分，TRIzol法提取总RNA。经紫外分光光度仪定量后，采用半定量RTPCR检测THmRNA水平。参照试剂盒说明建立25μLRT反应体系:取2μ gRNA,加入5μL5×Buffer、2.5μLMgSO4（40mmol/L）、2.5μLdNTP（各2.5mmol/L）、1μLOligodT、40URNaseInhibitor、30UAMV,加入RnasefreeH2O至25μL，混匀后置于45℃1h、99℃5min，得到cDNA。PCR引物参照文献设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。各个基因引物序列及扩增产物大小见表1。取10μL扩增产物于含TAE的20g/L琼脂糖凝胶中电泳，在天能凝胶紫外线摄像系统中照相并用天能分析软件对条带进行分析，将条带的面积和强度的乘积作为PCR产物的含量。TH/GAPDH、Bcl2/GAPDH和Bax/GAPDH分别表示TH、Bcl2、BaxmRNA的表达水平。表1TH、Bcl2、Bax和GAPDH引物序列基因上游引物1.6统计学处理结果以±s表示，用F检验行统计学处理。2结果2.1小鼠给予MPTP后的行为学观察小鼠在给予MPTP5～10min后逐渐出现肢体震颤、弓背、竖尾、竖毛、后肢张开、运动迟缓、步态不稳等改变，个别出现癫痫样发作，约30～60min后上述症状减轻，但仍有运动迟缓、姿势不稳，精神差，并出现肢体僵硬，活动明显减少；12 h后逐渐恢复正常。随MPTP给药次数增加，上述症状表现越趋明显。Ghrelin预处理可以有效减轻由MPTP引起的上述行为学改变。2.2Ghrelin对MPTP小鼠PD模型SN内THmRNA表达的影响MPTP导致小鼠SN内THmRNA的表达量减少，明显低于对照组(F=34.77，q=11.91，P<0.01)。Ghrelin+MPTP组小鼠SN内THmRNA表达量较MPTP组有所增加(q=5.05,P<0.01)，但与对照组相比，差别仍有显著意义(q=6.86,P<0.01)。见表2。2.3Ghrelin对MPTP小鼠PD模型SN内Bcl2和BaxmRNA表达的影响注射MPTP的小鼠SN内Bcl2mRNA的表达量较正常小鼠降低(F=6.20，q=4.44,P<0.05)，BaxmRNA的表达量升高(F=119.31，q=18.77,P<0.01)；Ghrelin预处理小鼠SN内Bcl2的mRNA水平较MPTP组有显著增加(F=6.20，q=4.17,P<0.05)，BaxmRNA降低(F=119.31，q=19.66,P<0.01)。MPTP组小鼠SN内Bcl2/Bax较对照组明显下降(F=111.59，q=17.58,P<0.01)，而Ghrelin+MPTP组Bcl2/Bax明显高于MPTP组(q=18.94,P<0.01)，可恢复至正常水平。见表2。表2Ghrelin对MPTP小鼠PD模型SN内TH、Bcl2和BaxmRNA表达的影响3讨论 Ghrelin是一种广泛分布于人、大鼠和多种动物体内的脑肠肽，主要由胃肠道合成、分泌，能够通过血脑脊液屏障，具有刺激生长激素释放，促进摄食等多种功能。近年来研究发现，Ghrelin能通过丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)途径促进3T3L1脂肪前体细胞的分裂增殖，并能够抑制脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞和内皮细胞的凋亡。最新的研究表明，10-3mol/LGhrelin可以抑制OGD导致原代下丘脑神经元的凋亡，增加Bcl2的表达，并能抑制细胞色素C的释放及caspase3的活性[5]。Ghrelin的受体有1a和1b两种亚型，其中1a是Ghrelin的功能性受体，多项研究表明GHSR1a可能介导了Ghrelin的细胞保护作用。有研究显示,GHSR1amRNA在大鼠和小鼠SNpc有较高表达，因此，Ghrelin可能对PD中SNpc的DA能神经元具有保护作用。MPTP制备的小鼠PD模型是目前用来研究PD发病凋亡机制的重要模型，MPTP可引起SN内DA能神经元的线粒体能量耗竭和氧化应激反应，诱发凋亡。MPTP的毒性代谢产物MPP+被DA转运体（DAT）摄取进入DA能神经元，可以抑制酪氨酸羟化酶TH活性，减少DA的合成；通过抑制NADH脱氢酶Ⅰ ，增加自由基的生成及氧化应激，这种氧化应激状态可以促进Bax的表达及其在线粒体外膜上的分布，从而改变线粒体膜的通透性，使膜内的某些蛋白，如细胞色素C等进入细胞质，启动凋亡过程[6]。本室的前期工作已表明，腹腔注射MPTP(30mg/kg,5d)可以造成SN内TH阳性细胞数目的显著减少，Bax免疫组织化学检测结果表明，MPTP可诱导促凋亡蛋白Bax的表达，导致SN内DA能神经元的凋亡[7]。本研究制备了亚急性MPTP小鼠PD模型，发现模型组小鼠SNpcTH基因mRNA的表达量较对照组明显减少，预先给予Ghrelin预防的PD小鼠TH表达量降低的幅度则低于MPTP组。TH是DA合成的限速酶，MPTP抑制THmRNA的表达，可造成小鼠SNpcDA能神经元功能的降低，诱发PD样的行为表现；而预防性给予Ghrelin可以减轻MPTP的神经毒性作用，减少由MPTP造成的TH表达降低的情况。为研究Ghrelin是否通过抑制凋亡的途径来减轻MPTP引起的小鼠行为改变和THmRNA表达量的减少，我们检测了SN内Bcl2和BaxmRNA表达情况。Bcl2蛋白家族与PD中DA能神经元凋亡密切相关。根据功能Bcl2蛋白家族被分为两类:一类促进细胞凋亡，如Bax、Bak和Bik等；另一类抑制细胞凋亡，如Bcl2、BclxL和BclPTP诱致PD小鼠SN中Bcl2mRNA表达的减少，抑制BaxmRNA表达的增加，使Bcl2/Bax降低甚至恢复到正常水平，表明Ghrelin可调节Bcl 2与Bax比例，可能是通过影响线粒体膜通透性来保护细胞，拮抗MPTP对DA能神经元的损伤，减轻由MPTP导致的SN内THmRNA表达减少的状况。本研究结果表明，Ghrelin能够保护MPTP小鼠PD模型SN的DA能神经元，其作用机制可能是通过调节Bcl2与Bax的比例，增加Bcl2的表达量，抑制Bax的表达，调控细胞抗凋亡系统，从而对抗MPTP诱导DA能神经元凋亡的作用。总之，本实验为Ghrelin功能的研究开拓了新的方向，为研究Ghrelin与SN纹状体DA能系统的关系奠定了基础，同时也为PD的治疗提供了新的实验依据。【