百草枯人工抗原合成及抗体制备

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1、百草枯人工抗原合成及抗体制备作者：杨婷婷，孙秀兰，邵景东，王洪新【摘要】目的：制备百草枯人工抗原和抗血清，为建立酶联免疫吸附法提供技术储备。方法：以4,4'联毗唳和碘甲烷为起始原料，于暗处通氮气保护下合成了百草枯半抗原；混合酸酉干法偶联大分子蛋白载体牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）制备免疫抗原和包被抗原；免疫新西兰大白兔，制备多抗。结果：合成的半抗原经HPLCMS、1HNMR和IR鉴定，初步确定合成成功；百草枯半抗原与BSA和OVA的结合比分别为19：1和14:1；抗血清经间接ELISA法检测，效价达l：2.56X104,经

2、饱和硫酸铁沉淀法纯化后抗体的效价达1：5.12X104o结论：合成的百草枯人工抗原具有较好的免疫原性，为百草枯酶联免疫检测（ELISA）试剂盒的研制提供了基础。【关键词】百草枯；抗原；抗体；免疫检测百草枯（paraquat,PQ）又名克无踪、对草快，化学名为1,1'二甲基4,4'联毗唳阳离子盐，是一种广谱、灭生性有机杂环类除草剂［1］。百草枯可经胃肠道、皮肤和呼吸道吸收，易导致肺纤维化［2］。为了保护人类健康和环境安全，许多国家严格限制使用百草枯［3］。我国2005年发布并实施的国家标准食品中最大农药残留限量中规定蔬菜、柑橘、小麦粉中

3、百草枯的最大残留限量分别为0.05、0.2、0.5ppm。高效液相色谱分析法、气相色谱分析法等仪器分析法样本前处理及测定过程繁琐，费用高，不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法(EnzymelinkedImmunosorbentassay,ELISA)灵敏度高，特异性强，仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于现场监控和大量样本筛查。特异性抗体的制备是建立免疫分析法的必要前提。百草枯的相对分子质量(Mr)仅为257000,属于半抗原，而且自身没有可供偶联的活性官能团(如氨基、竣基等)。本研究在前期工作中，选择百草枯结构类似物4

4、,4,联毗唳，设计和合成了具有活性竣基的百草枯半抗原。我们采用混合酸肝法合成人工抗原，并进行结构鉴定，经免疫新西兰大白兔后，获得了较高效价的特异性多克隆抗体。1材料和方法1.1材料二噁烷、无水三正丁胺、牛血清白蛋白(BSA).卵清蛋白(OVA)均购自Sigma公司；氯甲酸异丁酯购自Fluka公司；弗氏完全、不完全佐剂购自北京生物制品研究所;四甲基联苯胺(TMB)、羊抗兔IgG购自北京博奥森有限公司；其他试剂均为分析纯。紫外可见光分光光度计Spectronic1.70为意大利GBC公司产品；Nexus670型傅立叶变换红外光谱仪为Nic

5、olet公司产品；酶标仪MK3购自上海智理科学仪器有限公司。1.2方法1.2.1混合酸肝法合成百草枯人工抗原（1）取前期合成的百草枯半抗原（PQh）16mg溶于600uL二噁烷中，搅拌使其溶解。然后加入无水三正丁胺70UL,将此混合物在4工冰浴中冷却，并搅拌15mine加入重蒸的氯甲酸异丁酯30uL,4°C左右搅拌30mino（2）52mgBSA溶于4.5mL水中，用0.1mol/L的NaOH调pH至9.0。将上述PQh溶液逐滴加入到溶解的蛋白中，并于4°C轻微搅拌4h,整个过程维持pH在9.0o然后，将混合物于41对0.1mol/L

6、pH7.4的PBS中透析72h,每隔6h换透析液1次。冷冻干燥后于-2（TC保存。用同样的方法合成包被抗原PQhOVA[5]。1.2.2百草枯人工抗原结构的鉴定所得的百草枯人工抗原采用Nexus670型傅立叶变换红外光谱仪（IR）鉴定结构。1.2.3人工抗原偶联比的测定（1）摩尔消光系数e的测定。配制PQ浓度为0、0.01.0.02.0.03g/L的水溶液，通过紫外扫描可知PQ的最大吸收波长为260nm,在260nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔消光系数e=吸光值/摩尔浓度。(2)人工抗原中蛋白质含量的测定。采用Bradford法

7、测定人工抗原中蛋白质含量，以超纯水配制BSA浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1g/L,配制人工抗原浓度为1g/L,在波长为595nm下测定其吸光值，绘制CA曲线，并计算人工抗原中蛋白质含量［6］。(3)偶联比的测定。配制0.1g/LBSA的水溶液，将偶联产物用超纯水稀释到0.1g/L,在260nm处测吸光值，以超纯水为空白，吸光值为Al、A2。偶联比率r为：r=［(A2—A1)/£］/(0.1/65000),其中e为摩尔消光系数(L/mol),65000为BSA分子量，0.1为BSA浓度(g/L)o1.

8、2.4抗体的制备将合成的百草枯人工抗原(PQhBSA)免疫2只健康雄性新西兰大白兔(质量在2.0kg左右)。免疫前1周从耳缘静脉采血作阴性对照。称取1mgPQhBSA,用5mL0.1mol/L的PBS(经高压灭菌)溶解,