一种含egfp报告基因hcv复制子瞬时表达载体构建和验证

《一种含egfp报告基因hcv复制子瞬时表达载体构建和验证》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中国悱和医科人学硕l学位论文AmpBSAbpcDNADNAdNTPDEPCDTTEBkbLBnto．D．PBSPCRSDS英文名词及缩写AmpicillinBovineserumalbuminbasepaircomplementaryDNAdeoxyribonucleicaciddeoxynucleotidetfiphosphatediethyIpyrocarbonatedithiothreitolEthidiumbromidekilobasepairsLuriaBrothNucleotidcOpticaldensityph

2、osphate—bufferedsalinePolymerasechainreactionsodiumdodecylsulfate氨苄青霉素小牛血清碱基对互补脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷酸脱氧二磷酸核苷酸_二乙基焦炭酸盐_二硫苏糖酵溴化乙锭千碱基对一种培养基核苷酸光密度磷酸缓冲盐溶液聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠中困协和医科人学坝卜学位论文硕士学位论文原创性、真实性声明本人郑重声明：此处所提交的硕士学位论文《～种含EGFP报告基因的HCV复制子瞬时表达载体的构建和验证》，是本人在导师指导下，在中国协和医科大学基础医学院生物化学与分

3、子生物学系攻读硕士学位期问进行研究工作所取得的成果。据本人所知，论文中除已注明及致谢的部分外不包含他人已发表或撰写过的研究成果：对本文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明或致谢。本人对论文中所有实验数据和结果的真实性负责。研究生签字：日期：年月日硕士学位论文及论文相关实验材料使用授权书《一种含EGFP报告基冈的HCV复制子瞬时表达载体的构建和验证》系本人在中国协和医科大学基础医学院生物化学与分子针i物学系攻读硕士学位期间在导师指导下完成的硕士学位论文。本论文的研究成果(包括申请的专利)归中国协和医科人学

4、所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人完全了解叶_I国协和医科大学关丁保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门送交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅。本人授权中国协和医科大学，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。论文的全部或部分内容将根据论文所承担国家或地方级课题的要求，与导师商定后，予以公布。论文相关的所有实验材料归课题组所有，未经课题组长和导师同意，不得提供给他人。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日中田协和医科人学硕l学位论文一种含EGFP报告基因的HCV复制子瞬时表达载

5、体的构建和验证摘要丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)是丙型肝炎的致病体，全世界约有1．7亿丙肝感染者。HCV感染可有多种不同的临床表现，而大部分感染者发展成慢性肝炎，从而更易演变为肝硬化和肝细胞癌。由于丙型肝炎的严重危害，近年来，丙型肝炎病毒的研究特别是病毒分子生物学研究进展十分迅猛。1999年Lohmann等在Science上首先报道了选择性双顺反子亚基因组HCVRNA复制子系统，复制子在人肝癌细胞系Huh7中能高水平自主复制，这被公认为是HCVRNA体外复制模型研究获得突破性进展的单程碑。复制子系统的

6、建立，对HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究具有重要的意义。本工作意在构建一种能直观快速反应细胞内HCVRNA数量的重组HCVlb复制子，而无需利用G418筛选后再通过RT-PCR来检测细胞内的HCVRNA，对于定性评价某种化合物对于HCV的抗性有重要意义。该重组载体构建的基本思路为：利用Ascl和PmeI酶切位点将HCVIb亚基因组复制子内的G418抗性基因neo片段切下，同时利用PCR方法获得末端加入了上述两种酶切位点的EGFP片段，通过体外连接得到了一种不含G418抗性基因，而含有EGFP报告基因的重组HCVl

7、b亚基因组克隆pEGFP—Ib；该cDNA克隆经过体外转录，得到了重组的HCVlb亚基因组RNA，应用脂质体转染技术瞬时转染Huh7细胞后，却并未如预期结果检测到细胞荧光。然而工作中在相同实验条件下利用pEGFP-N1质粒瞬时转染Huh7细胞，能观察到明显的细胞荧光。关键词：丙型肝炎病毒，复制子，EGFP，Huh7细胞系，瞬时转染2中周协和医科人学硕I：学位论史ABSTRACTAnestimated170millionpersonsworldwidealeinfectedwitIlhepatitisCvirus(HCV)．t

8、hemainpathogensofchronichepatitisC．Thesepatientsareathighriskofdevelopingsevereliverdiseases，includingcirrhosis(1iverscarring)andhepat-oeellularc