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1、HCV复制子复制效率影响因素及意义【关键词】，肝炎病毒【关键词】肝炎病毒，丙型；复制子；变异(遗传学)；细胞容受性o引言自1989年丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)发现以来，HCV体外细胞模型研究一直是HCV研究的热点问题之一，能在人肝癌细胞系中高水平自主复制的HCV复制子系统的出现，大大加强了HCV体外复制机制的研究.至1999年复制子模型系统被首次描述以来，这个系统逐步得到了完善.特别是细胞培养适应性变异及宿主细胞容受性这两个能明显增强HCV体外复制能力的重要因素的发现，拓展了复制子系统的
2、应用领域，如瞬时复制系统、选择性全长基因组及基础研究和抗病毒药物筛选所需各种新型复制子的构建.最终，复制子系统将有助于诠释a干扰素抗性的分子基础.我们就复制子的适应性变异和细胞容受性问题进行综述.1细胞培养适应性变异1.1细胞培养适应性变异区域适应性变异现象[1-2]最初是通过在G418筛选的细胞克隆内复制的HCVRNA序列分析而发现的，在多种情况下，发现一个特定细胞内复制的复制子RNA分子群体内，HCV编码区至少可见一个位点变异,致一个氨基酸替代，而该氨基酸的替代在这个细胞克隆中所有RNA分子间是很保守的，尽管每
3、一个HCV非结构蛋白都可见这种“保守性”变异，它们集中于某些特定的区域.主要集中区域位于NS5A丝氨酸(该蛋白高度磷酸化所需氨基酸)富集的中心区域，研究显示该区域丝氨酸残基常被替代(S2197,S2201,S2204)[3],而NS5A高度磷酸化在控制HCVRNA复制过程中起着关键的作用[4],但迄今尚不清楚NS5A磷酸化的改变如何影响RNA复制.第二个适应性变异集中区域发生于NS3丝氨酸蛋白酶区域的竣基端及NS3螺旋酶的氨基端[3,5],三维结构显示大多数变异位于溶媒可接近的分子表面，在螺旋酶区域内，变异似乎限于
4、一个特定的表面，研究显示HCVNS3螺旋酶的RNA解链活性是RNA复制所必须的[6],而该区域的变异对复制功能的影响需进一步研究.第三个适应性变异集中区域见于NS4B的两个非常独特的位点[3,7],基于NS4B的拓扑模型，在K1846T位氨基酸发生替代的情况下，这两个位点位于与透膜区2和3连接的胞质环上，在1897位氨基酸发生替代的情况下，则位于透膜区4的胞质竣基端，在MT2C传代HCV基因组复制子中[7],还发现1897位苯丙氨酸替代纟颉氨酸，这个基因组是HCV感染MT2细胞克隆的共有序列并经历了多次传代，表明同
5、样的细胞培养适应性变异发生于不同的HCV分离株.最近，对长期细胞培养(12~18mo)中，HCV复制子的基因变异及复制动力学研究发现，复制子的基因变异呈现时间依赖性的累积，变异率约为每年每个位点3.0X10-3碱基替代，复制子的基因离散度(diversity)也随时间扩大，来自不同时间点的复制子RNA转染Huh7细胞揭示随时间累积的基因变异明显改善克隆形成效率M.1.2适应性变异对HCV复制的影响最初，将一些细胞培养适应性变异插入亲代复制子中，定量转染后测定G418抗性集落的数量，发现特定区域变异的插入致集落形成效
6、率增加，NS5A区某些变异的插入，集落形成效率较亲代增加1X104倍[1].功能性筛选检测发现高效率的复制子常有多个位点发生适应性变异.目前，有4个HCV分离株的复制子系统即：Coni[9],HCVN[10],H77[1]及JFH1[11]序列.HCVN与JFH1序列不需要适应性变异即能在Huh7细胞中有效复制，实验证明NS5A区4个氨基酸(SSYN)的插入与HCVN序列的有效复制有关.H77序列复制子至少需要两个适应性变异[1,5],S2204I,A1226D或P1496L,含有P1496L及S2204I的复制子
7、较仅含有S2204L复制子的复制效率高3X104倍，而含有A1226D及S2204I的复制子较仅含有S2204L复制子的复制效率髙800倍；仅含有P1496L复制子较含有P1496L及S2204I的复制子的复制效率低250倍，表明P1496L联合S2204I适应性变异是有效的H77复制子复制所必需的.Coni复制子的适应性变异研究较深入，发现了一系列的适应性变异位点［2,3］,其中，NS5B区R2884G适应性变异效率最高.在Coni复制子的研究中还证明了复制子的高水平复制无细胞毒性作用.此外，Lohmann等［3
8、］发现两个高度适应性变异位点的组合使复制子的复制能力明显下降.实验显示，与不含适应性变异的复制子比较，NS4B区P1936S变异复制能力增加12倍，NS5A区E2163G变异复制能力增加60倍，NS5B区R2884G变异的复制能力增加500倍，而NS4B加NS5B区联合变异，其复制能力仅增加20倍,NS5A加NS5B区联合变异则未见克隆集落的形成.因此，这些
