乳腺癌组织circrna差异性表达谱筛选和功能预测分析

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分类号：ＲＩ８单位代码：１０３１２：学号：２０１５密级１２０４響＊京氐种犬ｆ硕士学位论文题目：乳腺癌组织ｉｒｃＲＮＡ差异性表达谱筛选和功能预测分析：吕玲双研究生指导教师：王建明教授？学科专业：流行病与卫生统计学学院名称：南京医科大学公共卫生学院二〇一：八年六月完成时间 分类号：R18单位代码：10312密级：学号：20151204硕士学位论文题目：乳腺癌组织circRNA差异性表达谱筛选和功能预测分析研究生：吕玲双指导教师：王建明教授学科专业：流行病与卫生统计学学院名称：南京医科大学公共卫生学院完成时间：二〇一八年六月 南京医科大学硕士学位论文目录中文摘要.........................................................................................................................................1Abstract............................................................................................................................................4前言...............................................................................................................................................9第一部分乳腺癌组织特异性circRNAs的筛选及验证研究....................................................121材料与方法.......................................................................................................................122结果...................................................................................................................................213讨论...................................................................................................................................42第二部分乳腺癌相关circRNAs的功能预测分析....................................................................451村料与方法.......................................................................................................................452结果...................................................................................................................................463讨论...................................................................................................................................51参考文献.......................................................................................................................................53综述...........................................................................................................................................63附录一、英文缩略词表...............................................................................................................79附录二、乳腺癌患者信息收集表...............................................................................................80附录三、硕士期间发表文章.......................................................................................................81致谢...............................................................................................................................................82 南京医科大学硕士学位论文乳腺癌组织差异circRNA表达谱筛选和调控网络分析南京医科大学公共卫生学院流行病学系研究生：吕玲双导师：王建明教授中文摘要第一部分乳腺癌组织特异性circRNAs的筛选及验证研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有170万乳腺癌新发病例，严重威胁着女性的健康。随着人们生育和生活方式的改变，乳腺癌发病率呈不断上升的趋势。乳腺癌的发生与肥胖、缺乏运动、酒精使用、初潮年龄、绝经年龄、第一胎生育年龄、雌激素和孕激素使用等因素相关。然而家庭聚集现象以及在相同暴露下只有少数人患病的事实表明，个体遗传因素同样重要。circRNA（环状RNA）最早于上世纪70年代在RNA病毒中被发现，但一直被误认为是外显子转录本错误剪接而形成的低丰度RNA分子。近年来，研究发现circRNA与人类健康和疾病的发生发展密切相关，但与乳腺癌的关联研究还处于起步阶段。本研究采用芯片技术筛选乳腺癌相关的差异性表达circRNAs，评估其作为乳腺癌生物标志物的价值。方法本研究采用两阶段病例-对照研究设计。第一阶段是初筛阶段，收集新发乳1 南京医科大学硕士学位论文腺癌患者癌组织和癌旁组织共4对样本，利用circRNA芯片检测组织中circRNA表达谱，筛选差异表达的circRNAs，筛选标准为表达量差异倍数（foldchange，FC）>2倍，P<0.05。第二阶段是独立验证阶段，分别收集新发乳腺癌患者组织和癌旁组织样本51对、乳腺癌病例及健康对照血浆样本42对、3种乳腺癌细胞系和一个乳腺正常上皮细胞系，采用定量逆转录聚合酶链反应（quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction，qRT-PCR）技术，对初筛阶段筛选出的候选circRNAs进行验证研究，探讨差异表达的circRNAs与乳腺癌临床指标的相关性。采用受试者工作特征曲线（ReceiverOperatingCharacteristic，ROC）评价单个或者多个差异circRNAs作为乳腺癌筛诊断生物标志物的价值，计算曲线下面积（areaundercurve，AUC）。结果基于circRNA芯片共筛选出1155个候选差异表达circRNAs，其中715个上调circRNAs，440个下调circRNAs。对其中的6个候选差异表达circRNAs进行二阶段验证。结果表明，hsa_circ_103110，hsa_circ_104689和hsa_circ_104821在乳腺癌组织中表达水平升高，而hsa_circ_006054，hsa_circ_100219和hsa_circ_406697在乳腺癌组织中表达水平降低。通过绘制ROC曲线，进一步评估了这6个circRNAs对乳腺癌的诊断价值。发现hsa_circ_100219具有最高的诊断准确性，曲线下面积AUC为0.78（95％CI：0.69-0.88），灵敏度为0.69(0.54-0.81)，特异度为0.71(0.56-0.83)。若联合应用6个circRNAs时，AUC达到0.82（95％CI：0.74-0.91）。上述circRNAs在乳腺癌患者血浆和正常健康对照血浆中的表达量差异无统计学意义。细胞系分析发现，相对与乳腺正常上皮细胞，hsa_circ_104821在3种乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468）中表达均上调。结论circRNAs在乳腺癌组织和癌旁组织中存在差异表达谱，提示其可能作为乳腺癌筛查的潜在生物标志物。2 南京医科大学硕士学位论文第二部分乳腺癌相关circRNAs的功能预测分析背景circRNA具有“miRNA海绵体”效应或可以作为竞争性内源性RNA（competitiveendogenousRNA，ceRNA）与miRNA结合而抑制其活性，从而调控miRNA靶基因的表达，影响人体正常的生理功能，与多种疾病的发生发展有关。本次研究利用生物信息学分析策略，对差异表达的circRNAs进行功能预测，探讨其在乳腺癌发病中的作用机制。方法对第一部分采用circRNAs芯片筛选的乳腺癌组织circRNAs差异表达谱，进行基因本体论（GeneOntology,GO）和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGeneandGenomes，KEGG）分析，预测靶基因的相关功能及信号通路。结合qRT-PCR验证结果，应用Arraystar软件预测与circRNA结合的miRNA，对circRNA/miRNA的相互作用详细注释。结果GO分析结果显示，在乳腺癌组织表达上调的circRNAs中，富集程度最高的是生物过程（biologicalprocess,BP）、分子功能（molecularfunction,MF）、细胞组分（cellularcomponent,CC），分别为解剖结构发育过程、蛋白质结合、细胞质。在表达下调的circRNAs中，富集程度最高的BP、MF、CC，分别为跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、蛋白质结合、突触。KEGG通路分析结果显示，Hippo信号通路和WNT信号通路等途径与表达上调的circRNAs有关，RAP1信号通路和RAS信号通路与表达下调的circRNAs有关。单个circRNA与多个miRNAs有匹配的结合位点。结论circRNAs参与癌症相关信号通路，可以结合多个癌症相关miRNAs，参与乳腺癌的发生和发展过程。关键词：乳腺癌；RNA；非编码RNA；circRNA；生物标志物3 南京医科大学硕士学位论文ScreeningofdifferentiallyexpressedcircRNAsandintegratedanalysisofcircRNAsregulatornetworkinbreastcancerDepartmentofEpidemiology,SchoolofPublicHealthNanjingMedicalUniversityMasterCandidate:LingshuangLüSupervisor:JianmingWangAbstractPartone:Screeningandvalidationoftissue-specificcircRNAsinbreastcancerBackgroundBreastcancerisoneofthemostcommoncancersamongwomenintheworld,withanestimated1.7millionincidentcaseseachyear.Epidemiologicalstudieshaveshownthatobesity,physicalinactivity,alcoholconsumption,ageatmenarche,menopauseage,familyhistoryofbreastcancer,advancedmaternalageatthefirstbirth,andtheestrogenorprogestinuseareassociatedwiththeriskofbreastcancerinwomen.However,thefactoffamilyaggregationandthefactthatonlyafewpeoplesufferingfromthesameexposureindicatethatgeneticfactorsareessentialtobreastcanceretiology.CircRNAswerefoundinviroids,virusesandtetrahymenadecadesago,buttheywereinitiallyconsideredtobeby-productsofaberrantRNAsplicingor4 南京医科大学硕士学位论文splicingerrorsduetotheirlowexpression.Inrecentyears,studieshavefoundthatcircRNAiscloselyrelatedtotheoccurrenceanddevelopmentofdiseases.ButtherelationshipbetweencircRNAsandbreastcancerisstillinitsinfancy.Inthisstudy,weusedthechiptechnologytoscreenthedifferentiallyexpressedcircRNAsinbreastcancerandevaluatedthevalueofthemasbiomarkersforthediagnosisofbreastcancer.MethodsThisstudyusedatwo-stagecase-controldesign.Inthefirststage,fourpairsofbreastcancertissuesandadjacentnormal-appearingtissueswerecollectedandcompared.TheArraystarHumancircRNAArraywasusedtoconstructagenome-widecircRNAprofile.WescreenedthedifferentiallyexpressedcircRNAsusingthecriteriaoffoldchange(FC)>2andP<0.05.Inthesecondstage,50pairsofbreastcancertissuesandadjacentnormal-appearingtissues,42pairsofbreastcancerplasmaandhealthycontrolplasma,and3typesofbreastcancercelllinesandonenormalcelllinewereusedtovalidatetheexpressionofcircRNAsidentifiedfromthefirststage.Weusedthequantitativereal-timepolymerasechainreaction(qRT-PCR)todetecttheexpressionofcircRNAs.WealsoexploredtherelationshipbetweendifferentiallyexpressedcircRNAsandtheclinicalcharacteristicsofpatientswithbreastcancer.TheReceiverOperatingCharacteristic(ROC)curvetogetherwiththeareaundercurve(AUC)wereusedtoanalyzethediagnosticvalueofspecificcircRNA.ResultsBasedonthechipscreening,weidentified1155differentiallyexpressedcircRNAs.Amongthem,715wereupregulatedand440weredownregulatedinbreast5 南京医科大学硕士学位论文cancertissues.SixcandidatecircRNAswereselectedforfurthervalidation.Datafromthesecondstageshowedthattheexpressionlevelofhsa_circ_103110,hsa_circ_104689andhsa_circ_104821wereelevatedinbreastcancertissues,whereashsa_circ_006054,hsa_circ_100219andhsa_circ_406697weredownregulated.ByplottingtheROC,wefoundthathsa_circ_100219hadthehighestdiagnosticaccuracy,withanAUCof0.78(95%CI:0.69-0.88),thesensitivityof0.69(95%CI:0.54-0.81),andthespecificityof0.71(95%CI:0.56-0.83).Whenwecombinedthehsa_circ_006054,hsa_circ_100219andhsa_circ_406697asthebiomarker,theAUCwas0.82(95%CI:0.73-0.90).TherewasnosignificantdifferenceintheexpressionofcircRNAsinplasmabetweenbreastcancerpatientsandnormalhealthycontrols.Thehsa_circ_104821wasfoundtobeup-regulatedinthreetypesofbreastcancercelllines(MCF-7,MDA-MB-231andMDA-MB-468).ConclusionCircRNAisdifferentiallyexpressedinbreastcancerandadjacentnormal-appearingtissues,andcanbeusedasanewclassofbiomarkersforhumanbreastcancer.6 南京医科大学硕士学位论文Parttwo:GeneFunctionanalysisofdifferentiallyexpressedcircRNAsinbreastcancerBackgroundRecentevidencehasindicatedthatcircRNAscanregulategeneexpressionbyactingasamiRNA“sponge”orasacompetitiveendogenousRNA(ceRNA).AberrantexpressionofcircRNAsaffectsthenormalphysiologicalfunctionofhumanbodyandisrelatedtothedevelopmentofmanydiseases.Inthisstudy,wesuedthebioinformaticsanalysistopredictthefunctionofthedifferentialcircRNAsandexploretheirmechanismsinthecarcinogenesisofbreastcancer.MethodsBasedonthedifferentialexpressionprofileconstructedinthefirststage,weperformedthegeneontology(GO)analysisandKyotoencyclopediaofgenesandgenomes(KEGG)Pathwayanalysistopredictthefunctionandsignalpathwayoftargetgenes.WealsousedtheArraystarsoftwaretopredictandannotatecircRNA-miRNAinteractions.ResultsGOanalysisindicatedthatthehighestenrichedtermcorrespondingtoup-regulatedtranscriptswere“transmembranereceptorproteintyrosinekinasesignalingpathway(ontology:biologicalprocess)”,“proteinbinding(ontology:molecularfunction)”and“synapse(ontology:cellularcomponent)”andthehighestenrichedtermcorrespondingtodown-regulatedtranscriptwere“single-organismdevelopmentalprocess(ontology:biologicalprocess)”,“cytoplasm(ontology:7 南京医科大学硕士学位论文molecularfunction)”and“proteinbinding(ontology:cellularcomponent)”.TheKEGGpathwayanalysisshowedthattheHipposignalingpathwayandtheWNTsignalingpathwaywererelatedtotheupregulatedcircRNAs,andtheRAP1signalingpathwayandtheRASsignalingpathwaywererelatedtothedownregulatedcircRNAs.EachcircRNAcanbindmultiplemiRNAs.ConclusionscircRNAsareinvolvedincancer-relatedsignalingpathwaysandcanbindmultiplecancer-relatedmiRNAsandmaybeinvolvedinthedevelopmentofbreastcancer.Keywords:breastcancer;RNA;non-codingRNA;circRNA;biomarker8 南京医科大学硕士学位论文前言乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全球每年有150万乳腺癌新发病例，严重威胁着女性的生命健康。乳腺癌同样也是我国女性最常见的肿瘤，2015年，[1]我国有27.24万乳腺癌新发病例，7.07万人死于乳腺癌。经典流行病学研究显示，随着人们生育和生活方式的改变，乳腺癌发病率呈上升趋势，所造成的疾病负担日益严重。乳腺癌的发生与初潮和绝经年龄、癌症家族史、肥胖、饮[2-5]酒等因素有关。然而家庭聚集现象以及在相同暴露下只有少数人患病的事实表明，个体遗传因素同样重要。随着分子生物学技术进展和人类基因组计划实施，全基因组关联研究[6-9]（GWAS）发现了一系列乳腺癌遗传易感多态位点（SNPs），为识别高危人群，实施精准预防和开展个体化治疗提供了可能。然而研究发现，虽然一些突变频率较高的多态位点与乳腺癌的遗传易感性间关联具有统计学意义，但相对危险度较低，人群归因危险度不大，即肿瘤的发生无法用单纯的遗传多态来解释，提示仅仅依靠SNPs位点尚无法满足乳腺癌高危人群识别、诊断和预后预测的需要。随着研究深入，科学家发现生物体内还存在一种新的基因调控机制，[10-12]即表观遗传(epigenetics)改变。表观遗传是非碱基序列差异的表型改变，在细胞分裂过程中基本保持稳定，是一种潜在的生物标志物和药物靶点。表观遗传主要包括DNA甲基化、组蛋白[13-17]修饰、基因印迹以及非编码RNA（Non-codingRNA，ncRNA）等，是一种基因序列外可遗传物质发生的变化，且这种变化在生长发育和细胞增殖过程中能稳定传递。与传统的蛋白类生物标志物相比，表观遗传改变常常是细胞癌[18]变过程中更为早期的事件，所致的基因调控异常在肿瘤发生、发展过程中更[19-22]为普遍。如果能够建立灵敏、特异的表观遗传模式谱，在疾病的早期阶段[23]即能识别出这种改变，无疑对实现乳腺癌的“三早”具有重要意义。[13-17]ncRNA等转录后调控因子是一种常见的表观遗传改变，曾因不能编码蛋白而被认为是“垃圾RNA”。随着研究深入，人们才发现ncRNA其实并非是无9 南京医科大学硕士学位论文用的基因剪切副产品，而是基因表达调控不可或缺的部分，在生物信息领域扮演着重要角色，有关ncRNA的研究也多次入选“世界科学十大进展”。ncRNA的研究热点是miRNA，这是一类进化上高度保守的单链非编码RNA，由17-25个[24]核苷酸组成，能够以不完全互补的方式与靶基因3’UTR区域结合，对基因转[25]录和稳定性起调控作用，可以参与几乎全部病理生理过程。由于单个miRNA的变化可能影响下游成百上千个功能各异的mRNA，因而它被认为是一类新的[26,27]疾病发生和预后生物标志物。相较于学术界轰轰烈烈的miRNA研究，ncRNA的另一个家族成员“环状RNA（circRNA）”却一直倍受冷落。circRNA最早于上世纪70年代在RNA病[28]毒中被发现，但一直被误认为是外显子转录本错误剪接而形成的低丰度RNA[29,30][31,32]分子。随着高通量测序技术和生物信息学发展，科学家发现circRNA[28,33,34]其实在人体组织细胞中是广泛表达的，有时甚至超过线性RNA表达量[35,36][37]的10倍之多，且具有组织、时间和疾病特异性。与线性RNA的产生模式不同，circRNA主要通过“套索驱动环化”和“内含子配对驱动环化”剪切模式。前者是3'端剪接配体与5'端受体共价结合，后者是内含子互补序列介导外[36,38,39]显子环化。这种独特的闭合环状结构能保护其免受外切酶的影响，因而[36]是一种表达稳定的潜在生物标志物。circRNA具有“miRNA海绵”效应或作为竞争性内源RNA（ceRNA）与miRNA结合而抑制其活性，从而调控miRNA靶标，影响人体正常的生理功能，[40-42][43]与多种疾病的发生有关。哈佛医学院Salmena等提出的ceRNA调控假说认为，circRNA的生物学功能是通过miRNA应答元件(miRNAresponseelement，MRE)完成的。circRNA上存在多个miRNA的互补结合位点，可像海绵般地吸[44]附miRNA，减少miRNA对靶基因的负性调控作用。circRNA除了具有miRNA海绵效应外，还可以通过部分碱基配对直接作用于靶基因或作为蛋白合成模板[45]。由于circRNA的转录后调控效应，使得它成为一种理想的药物靶标，可以[46]模拟其分子特点进行新药研发，这将给疾病的治疗提供新的手段，但在肿瘤学领域的研究尚处于起步阶段。10 南京医科大学硕士学位论文随着分子生物学技术进步，人类对疾病的认识从宏观到微观，从环境到基因，从遗传到表观遗传，逐步深入。越来越多的学者认为，肿瘤的发生是多因素协同作用的结果。以表观遗传为例，基因5’端启动子区DNA甲基化能影响启动子活性，而miRNA则从3’UTR区发挥调控功能，二者既能协同作用，也能[47]相互制约，研究发现，约10%的miRNA表达受到DNA甲基化的影响；而circRNA可作为miRNA海绵或缓冲剂，通过吸附或释放miRNA来影响靶基因表达。基于上述背景，我们提出如下科学假设：circRNA通过miRNA海绵作用影响靶标基因表达，与乳腺癌的发生发展有关，构建特异性的circRNA、miRNA表观遗传模式谱作为乳腺癌诊断的生物标志物具有可行性。为了验证这一假设，我们运用现场流行病学和分子流行病学技术手段，通过环境因素与表观遗传研究相结合、生物标志物检测与功能学研究相结合、分析表观遗传调控网络在乳腺癌诊断中的作用。由于表观遗传改变是肿瘤发生过程的早期事件，识别并构建特异性表观遗传模式谱对于乳腺癌早期诊断和预后具有重要价值，通过外周血检测相关生物标志物更是为寻找无创性诊断技术提供了线索。对circRNA的认识不仅丰富了竞争性内源RNA调控网络，而且为深入研究人类疾病的发生机制和治疗手段提[48]供了新方向。由于可根据circRNA的分子特点人工模拟合成，因而该研究结果也具有潜在的肿瘤治疗学应用前景。本项目的实施，将有助于加深对乳腺癌发病机制的认识，对于乳腺癌预防和控制将具有重要意义。本课题采用二阶段研究设计，首先采用circRNA芯片初筛乳腺癌组织中异常表达的circRNA，然后采用定量逆转录聚合酶链反应（quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction，qRT-PCR）技术，扩大样本，对乳腺癌组织和癌旁组织、血浆样本中circRNAs表达水平进行检测，探讨circRNA作为乳腺癌诊断生物标志物的价值，并进一步在乳腺癌细胞系和乳腺正常上皮细胞系中定量检测。此外，通过生物信息学，初步探讨差异表达circRNAs可能结合的miRNAs以及作用机制。11 南京医科大学硕士学位论文第一部分乳腺癌组织特异性circRNAs的筛选及验证研究乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，也是引起女性癌症相关死亡的主要原因。WHO报告，2012年全球约有170万新发乳腺癌患者和521,900例乳腺癌死亡病[49]例。研究提示，乳腺癌的发生与肥胖、雌激素和孕激素使用、缺乏运动和饮酒等有关。然而家庭聚集现象以及在相同暴露下只有少数人患病的事实表明，[50,51]个体遗传因素同样重要。[28]环状RNA（circRNA）是一大类具有调节能力的内源性非编码分子。早在上个世纪70年代，circRNAs在类病毒和病毒中被发现，但由于表达量低而[29,52]被认为是RNA异常剪接或剪接错误的副产物。随着高通量测序和生物信[31]息技术发展，科学家发现circRNA其实在人体组织细胞中是广泛表达。现有研究证明circRNAs异常表达与结肠直肠癌，基底细胞癌和膀胱癌的发生有关[53-55]。最近研究发现，circRNA与乳腺癌的发生有关，但只有初步的研究结果，[56,57]缺乏实验和临床证据。本次研究采用二阶段分子流行病学方法，首先利用芯片检测技术建立乳腺癌差异circRNA表达谱，然后在大样本中验证，识别在人乳腺癌中异常表达的circRNA。1材料与方法1.1研究对象第一阶段（初筛阶段），4例乳腺癌病例于2016年3月招募自宜兴市人民医院。第二阶段（验证阶段）乳腺癌病例为2016年3月~2016年6月期间在江苏大学附属医院、宜兴市人民医院和苏州大学第一附属医院确诊的住院手术的乳腺癌患者，共计51例。入选病例的标准为：①女性；②有乳腺癌病理诊断依据；③无既往患癌史；④无艾滋病病毒感染/艾滋病；⑤年龄大于18岁；⑥有手12 南京医科大学硕士学位论文术标本；⑦知情同意。病例排除标准：①合并其他自身免疫性疾病者；②合并其它恶性肿瘤者；③合并严重心、肝、肾功能衰竭者；④合并严重感染者。所有患者在术前均未接受过化疗、放疗及内分泌治疗。根据美国癌症联合委员会[58]的恶性肿瘤分期系统（TNM）分类确定肿瘤分期。收集乳腺癌病例血浆，共42例，病例均来源于2016年3月~2016年6月期间在江苏大学附属医院、宜兴市人民医院和苏州大学第一附属医院确诊的住院手术的乳腺癌患者。根据年龄、性别与乳腺癌患者进行匹配，收集正常对照血浆42例，对照来自2016年6月~2016年7月在宜兴市人民医院参加健康体检的人群，共计42例。对照符合以下入选标准：①无乳腺癌病史；②无其它恶性肿瘤史；③未长期使用糖皮质激素类药物或免疫抑制剂；④本人或直系亲属无自身免疫性疾病；⑤知情同意。本研究得到南京医科大学伦理委员会的批准。研究开始前，获取所有研究对象知情同意。1.2样本采集乳腺癌患者在手术时，由外科医生采集乳腺癌癌组织及癌旁乳腺组织标本。癌旁组织为距离乳腺癌组织5厘米以上切口边缘组织。样本取材后放置于组织保存液，然后置于-80℃超低温冰箱保存。采用EDTA抗凝管采集静脉血5ml，尽快进行血浆分离（3000r/min，10min，分离血浆和细胞组分），将血浆、红/白细胞分装至塑料离心管，编号后放入−80°C冰箱中冻存备用。1.3乳腺癌细胞系和乳腺正常细胞系本次研究采用了3种乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468）和1种乳腺正常上皮细胞系（MCF-10A），所有细胞均购买于中国科学院细胞库。1.4资料收集采用患者信息收集表收集一般情况和临床资料。一般情况包括：年龄、性别、地址、联系电话、民族、家族患癌史和月经状态等。患者临床资料主要包括：TNM分期、肿瘤大小、分化程度、病理类型、组织学分级、阳性淋巴结个13 南京医科大学硕士学位论文数、雌激素受体（estrogenreceptor，ER)、孕激素受体（progestinreceptor，PR)、人类表皮生长因子受体（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2）。收集正常对照人员的一般情况信息，包括年龄、性别、地址、联系电话和民族等。1.5主要实验器材高温灭菌器美国ZEALWAY公司超低温冰箱美国ThermoFisherScientific公司台式恒温离心机美国ThermoFisherScientific公司微型离心机美国SCJLOGEX公司低温离心机美国Eppendorf公司NanoDrop2000美国ThermoFisherScientific公司ABI实时荧光定量PCR仪美国LifeTechnologies公司梯度PCR仪美国AppliedBiosystems公司移液器美国ThermoFisherScientific公司电泳槽北京六一仪器厂凝胶成像仪美国伯乐公司1.6主要实验试剂TRIzolLS美国Invitrogen公司TRIzol美国Invitrogen公司RNeasyMiniKit德国Qiagen公司miRNeasySerum/PlasmaKit德国Qiagen公司DEPC水英国Abcam公司HumancircRNAMicroarrayV3.0芯片美国Arraystar公司PrimeScript™RTreagentKit(Perfect日本Takara公司RealTime)组织保存液上海伯豪生物技术有限公司三氯甲烷中国上海凌峰化学试剂有限公司无水乙醇中国国药集团化学试剂有限公司14 南京医科大学硕士学位论文circRNAs引物中国南京锐真生物技术有限公司SafeView核酸染剂加拿大ABM公司100bpDNALadder北京索莱宝科技有限公司6×DNALoadingBuffer上海莱枫生物科技有限公司琼脂糖西班牙Biowest公司1.7circRNA芯片初筛试验使用ArraystarHumanCircularRNA芯片V2（目录号：AS-CR-H-V2.0，ArraystarInc.，MD，USA）鉴定在乳腺癌组织和癌旁正常组织间差异表达的circRNAs。该阵列覆盖了13617个人类circRNAs。根据制造商提供的方案进行样品标记和阵列杂交分析。采用RnaseR（Epicentre，Inc.）消化总RNA以除去线性RNA并富集环状RNA。然后，利用随机引物法（ArraystarSuperRNALabelingKit;Arraystar）扩增富集的环状RNA并转录成荧光cRNA。标记的cRNA通过RNeasyMiniKit纯化。通过NanoDropND-1000测量被标记的cRNA（pmolCy3/μgcRNA）的浓度和活性利用。1μg标记的cRNA通过加入10×封闭剂5μl和25×裂解缓冲液1μl进行片段化，然后在60°C加热30min，最后加入2×杂交缓冲液25μl稀释标记物的cRNA。将50μl杂交溶液分配到垫片中并和circRNA微阵列表达垫片组装。将载玻片在AgilentHybridizationOven中65℃孵育17小时。然后采用AgilentScannerG2505C洗涤，固定并扫描。芯片检测结果采集和分析由上海康成生物技术有限公司协助完成。1.8总RNA提取及质量控制1.8.1组织中总RNA将50-100mg组织在液氮中磨碎，加入1mlTRIzol，用匀浆仪进行匀浆(样品体积不超过TRIzol体积的10%)；将匀浆样品在室温（15℃-30℃）放置5min，使核酸蛋白质复合物完全分离；加入0.2ml氯仿（0.2体积TRIzol），盖上盖子，手动剧烈振荡15s，室温15 南京医科大学硕士学位论文（15℃-30℃）放置3min；离心，4℃，12000r/min，15min（管子编号）。离心后，样品分三层（底层：红色有机相，上层：无色水相，中间薄膜层）。RNA在水相，水相体积是TRIzol的60%，约600ul；将水相转移至新管中（避免转移任何界面），加入1.5ml无水乙醇（1.5体积TRIzol），上下充分完全混匀几次，不需离心；将混合物700ul加入离心柱，包括可能产生的任何沉淀物。离心柱放置于2ml的收集管内。轻柔地盖上盖子，13000r/min，离心15s。弃废液。若样品大于700ul，则重复本操作；加入700ulRWT至离心柱，轻柔地盖上盖子，13000r/min，离心15s，弃废液；加入500ulRPE至离心柱，轻柔地盖上盖子，13000r/min，离心15s，弃废液；加入500ulRPE至离心柱，轻柔地盖上盖子，13000r/min，离心2min；将离心柱放入新的2ml收集管（试剂盒中提供），弃旧的收集管和废液，13000r/min，离心1min；将离心柱放入新的1.5ml收集管（试剂盒中提供），往离心柱中加入20ulRNase-free水，轻柔地盖上盖子，13000r/min，离心1min；RNA浓度测定，-80℃保存。1.8.2血浆中总RNA准备血浆样本200ul，将在-80°冻存的血浆放置在冰上解冻30min左右，待完全溶化后，采用高速冷冻离心机4℃，12000r/min离心10分钟，以去除细胞碎片；加入TRIzolLS1ml，震动或者上下颠倒；混合物在室温放置5分钟；加入200ul的氯仿，小心盖上盖子，震动或者剧烈晃动15s；室温放置2-3分钟；16 南京医科大学硕士学位论文4℃，12000r/min，离心15分钟（此时分3层，上层无色的水相，包含RNA，中间白色薄膜层，下层是红色的无机物）；将上层水相（大概600ul）移至新的收集管中，避免任何的中间层，加入1.5体积的无水乙醇（约900ul），上下颠倒数次完全混匀，不需离心，直接下一步操作；将700ul混合物转移至2ml离心柱里，包括沉淀。轻柔的盖上盖子，13000r/min，15s，室温，倒废弃液。再重复此步骤两次；加入700ulRWT至离心柱。轻柔的盖上盖子，13000r/min，15s，室温。倒弃废液；加入500ulRPE至离心柱。轻柔的盖上盖子，13000r/min，15s，室温。倒弃废液；加入500ul80%乙醇至离心柱。轻柔地盖上盖子，13000r/min，2min，室温。离心后倒弃废液（80%乙醇由96-100%的乙醇加上无RNA水配置而成）；将离心柱放在2ml的收集管中（试剂盒提供），将离心柱的盖子打开，13000r/min，5min。弃掉收集管。为了不损伤离心柱的盖子，离心时间隔放置离心管，中间留出一孔空置。盖子的方向与旋转方向相反。因残留的乙醇会干扰下游的反应，离心时打开盖子是为了在RNA洗脱时无乙醇残留；将离心柱放在1.5ml的收集管中，在离心柱的薄膜中间加入RNase-free水14ul。小心关上盖子，13000r/min，1min；RNA浓度测定，-80℃保存。1.8.3细胞中总RNA提取乳腺癌细胞株MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468釆用含10%FBS、青霉素100U/ul、链霉素100U/mL的RPMI1640培养液传代培养，在37°C、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养，细胞生长状态良好时用于实验。选取对数生长期的细胞，接种于6孔培养板，于24h后收集细胞；每孔中加入800μlTRIzol，用移液器吹打细胞，并收集到1.5mlEP管中；17 南京医科大学硕士学位论文再加入200μl三氯甲烷，充分震荡后，静置5分钟，4℃，12000r/min，离心10min；小心吸取上清，约400μL，置于新EP管中，再加入等体积异丙醇，-20℃放置1小时；4℃，12000r/min，离心10min，得到RNA沉淀，用30μLDEPC水溶解沉淀，备用。1.9cDNA合成组织和细胞RNA逆转录体系：冰上配制反应液，配制如下逆转录反应体系5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2μlTotalRNA*RNaseFreedH2Oupto10μl*使TotalRNA达到500ng，所需TotalRNA的体积等于500ng/每个样本TotalRNA的浓度。血浆RNA逆转录体系：冰上配制反应液，配制如下逆转录反应体系5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）2μlTotalRNA8μlRNaseFreedH2Oupto10μl短暂离心后置于PCR扩增仪中进行逆转录反应，反应按以下程序进行：Step1：37℃15minStep2：85℃5secStep3：4℃反应结束后，cDNA置于冰上待用或−80℃保存。1.10qRT-PCR试验1.10.1内参选择和引物设计依据第一阶段芯片初筛结果，从中选取6个差异表达的circRNAs进行qRT-PCR验证，包括：hsa_circ_103110，hsa_circ_104689，hsa_circ_104821，18 南京医科大学硕士学位论文hsa_circ_006054，hsa_circ_100219和hsa_circ_406697。选用磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH）作为内参对照。PCR引物由南京锐真公司合成，基于Primer3网站(http://primer3.ut.ee/)设计引物，应用primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行引物序列验证。表1.qRT-PCR引物序列Table1.PrimersdesignedforqRT-PCRCircRNAForwardprimersReverseprimershsa_circ_103110CCGGATGACATCAGAGCTACTACACTTCCGTCTGTCTCCAAhsa_circ_104689TGGCAGTGAAAAGAAGGGGTTGAAAGAAATGTGGCATGTGAGAhsa_circ_104821CCACCACATTACTTAGGTTGCACGTTCCGGCTCAGTTTTAGGhsa_circ_006054TCCTGTGACTGAAGTGCTGAGTCTAGATGTCGCCAGTCCAhsa_circ_100219TGCTACAGACGACTCAGAGAAGATGATGAAGGTGGTGGCAhsa_circ_406697GAGACAGATTTAAGGCCTGCCGGTAGATGTGGCTTTCCCCAGAPDHAGAAGGCTGGGGCTCATTTGAGGGGCCATCCACAGTCTTC1.10.2qRT-PCR反应操作步骤在冰上溶化低温冻存的cDNA，如下分别配制qRT-PCR反应体系：SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）5µlROXReferenceDyeII（50×）0.2µlPCRForwardPrimer（10µM）0.2µlPCRReversePrimer（10µM）0.2µl灭菌ddH2O至9.0µl将cDNA和qPCR反应体系短暂离心后，在384-PCR板对应的孔中加入相应的9µlqPCR反应体系，再加入1µlcDNA，小心黏上封口膜，将384-PCR板短暂离心混合，每个样本做三个平行反应体系；19 南京医科大学硕士学位论文将上述384-PCR板置于ABI实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR反应，按以下程序进行PCR反应：Pre-denaturation95℃30sPCRreaction（40cycles）95℃5s63/65℃34sDissociationStage95℃15s60℃1min95℃15s1.11数据处理与统计分析1.11.1circRNA芯片初筛使用AgilentFeatureExtraction软件（GeneSpringGXv12.1）读取芯片扫描图片，得到原始数据。然后用R软件包对数据进行归一化及标准化处理。通过P值、阳性结果错误率（falsediscoveryrate,FDR）、差异倍数（foldchange，FC）筛选两组样品间差异表达的circRNAs。对P<0.05且差异倍数FC>2倍的circRNAs通过火山图（volcanoplot）和热图（heatmap）标示。对多个差异circRNAs进行层次聚类和关联分析。1.11.2qRT-PCR验证分析circRNAs的表达水平采用GAPDH标化，相对表达量计算选用△Ct法，计算每一种被检测circRNA的△Ct值，△Ct=Ct待测circRNA−CtGAPDH。采用配对t检验分析乳腺癌组织和癌旁对照组织、乳腺癌患者血浆和对照组血浆之间的表达差异。乳腺癌细胞和正常细胞之间的差异circRNA采用单因素方差分析，两两比较采用pairwiset-tests检验。利用受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC）分析评估差异circRNA的诊断价值，计算曲线下面积（AreaUnderCurve,AUC）、灵敏度和特异度等指标。所有统计学检验均为双侧检验，以P<0.05有统计学意义。使用R3.3.1软件(https://www.r-project.org/)和GraphPadPrism5(GraphPadSoftware,LaJolla,CA)进行数据分析和绘图。20 南京医科大学硕士学位论文2结果2.1circRNA芯片初筛2.1.1研究对象的主要特征第一阶段选择4个乳腺癌患者（C1、C2、C3、C4）为研究对象，对乳腺癌组织和配对的癌旁组织进行circRNA芯片检测。患者均为女性，患者的主要人口学资料和临床信息见表2。表2.circRNA芯片筛选阶段研究对象的基本特征Table2.Detailedinformationaboutthepatientsincludedinthemicroarrayanalysis样本年龄民族月经状况TNMERPRHER2组织学类型C146汉族未绝经T2N0M0阳性阳性阴性浸润性导管癌C262汉族绝经T2N0M0阳性阳性阳性浸润性导管癌C341汉族未绝经T2N2M0阳性阴性negative浸润性导管癌C474汉族绝经T1N0M0阳性阴性阳性浸润性导管癌ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；HER2：人类表皮生长因子受体2.1.2circRNA芯片扫描图共获得芯片检测图8份，其中癌组织4份（记为T1、T2、T3、T4)，癌旁组织4分（记为N1、N2、N3、N4）。各组芯片扫描图均显示，芯片杂交后的探针荧光信号均匀清晰，整体背景强度低，且无边缘效应，无刮擦痕迹及水渍，芯片检测图见图1。21 南京医科大学硕士学位论文图1.circRNA芯片扫描图Figure1.ScanningimagesofcircRNAmicroarray2.1.3circRNA芯片质控结果通过对芯片探针荧光信号的采集和分位数标准化处理后，使芯片的基础荧光信号强度一致，从而对芯片数据进行质量控制，并绘制箱式图（boxplot）。如图2所示，8张芯片中（癌组织4张，记为T1、T2、T3、T4；癌旁组织4张，记为N1、N2、N3、N4）circRNAs表达谱标准化后的荧光信号强度均基本一致。图中横坐标是8个组织样本，纵坐标是标化强度值。22 南京医科大学硕士学位论文图2.circRNA芯片质控箱式图Figure2.BoxplotforqualitycontrolofcircRNAmicroarray2.1.4筛选组织中差异circRNAs按照P<0.05且FC>2倍的标准，筛选差异表达circRNAs。在乳腺癌组织和癌旁组织中，共检测到1155个差异表达circRNAs，其中715个在癌组织中表达上调，440个在癌组织中表达下调。根据P值和FC绘制火山图（图3）。图中的红点即为差异表达的circRNAs，左边的红点代表癌组织中表达下调的circRNAs，右边的红点代表癌组织中表达上调的circRNAs。表3A和3B分别列出了差异表达倍数最显著的100个表达上调的circRNAs和100个表达下调的circRNAs。其中上调的circRNAs中FC最大的是hsa_circRNA_005230（Alias：hsa_circ_0005230），下调的circRNAs中FC最大的是hsa_circRNA_406225。23 南京医科大学硕士学位论文图3.差异表达circRNAs的火山图Figure3.VolcanoplotofdifferentiallyexpressedcircRNAs24 南京医科大学硕士学位论文表3A.乳腺癌中表达上调的前100个circRNAsTable3A.Thetop100up-regulatedcircRNAsinbreastcancercircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_005230hsa_circ_00052300.04470.157312.1977NR_038397DNM3OShsa_circ_103254hsa_circ_00012470.00610.08958.1554NM_013236ATXN10hsa_circ_103552hsa_circ_00073310.00580.08777.2008NM_012287ACAP2hsa_circ_101981hsa_circ_00075080.00300.07666.7622NM_003010MAP2K4hsa_circ_063763hsa_circ_00637630.00470.08316.7249uc003bgn.2ATXN10hsa_circ_103253hsa_circ_00012460.00560.08756.4669NM_013236ATXN10hsa_circ_103902hsa_circ_00069160.00950.09605.9285NM_004272HOMER1hsa_circ_002908hsa_circ_00029080.00290.07665.8954NM_005607PTK2hsa_circ_102736hsa_circ_00010160.01180.10015.7227NM_003400XPO1hsa_circ_104327hsa_circ_00019710.02020.11775.6823NM_032581FAM126Ahsa_circ_102737hsa_circ_00010170.01520.10735.6438NM_003400XPO1hsa_circ_104328hsa_circ_00052510.00860.09445.6178NM_032581FAM126Ahsa_circ_402986-0.01120.09915.5877NM_000935PLOD2hsa_circ_001588hsa_circ_00015880.02690.12885.4942NM_003545HIST1H4Ehsa_circ_017359hsa_circ_00173590.03260.13915.4801NM_006624ZMYND11hsa_circ_030453hsa_circ_00304530.01920.11595.3866NM_005358LMO7hsa_circ_104692hsa_circ_00856160.00530.08595.3554NM_001247996ASAP1hsa_circ_100518hsa_circ_00082250.03570.14465.3078NM_006624ZMYND11hsa_circ_402294-0.03200.13835.2952NM_005722ACTR2hsa_circ_102611hsa_circ_00073340.00090.06355.2394NM_138799MBOAT2hsa_circ_102851hsa_circ_00080320.00560.08755.2165NM_003642HAT1hsa_circ_103110hsa_circ_00047710.00460.08265.1895NM_003489NRIP1hsa_circ_100354hsa_circ_00146130.01120.09915.1009NM_004632DAP325 南京医科大学硕士学位论文续表3AcircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_101436hsa_circ_00005670.00770.09365.0845NM_032233SETD3hsa_circ_104220hsa_circ_00069360.00890.09455.0660NM_005389PCMT1hsa_circ_100543hsa_circ_00002110.01010.09705.0495NM_001018039SFMBT2hsa_circ_101505hsa_circ_00028910.00380.08154.9904NM_005313PDIA3hsa_circ_101506hsa_circ_00035980.00460.08304.9443NM_005313PDIA3hsa_circ_400945-0.03600.14514.9116NM_030674SLC38A1hsa_circ_104707hsa_circ_00032210.00780.09364.7106NM_005607PTK2hsa_circ_104911hsa_circ_00884740.01490.10704.6907NM_020946DENND1Ahsa_circ_100141hsa_circ_00073640.00880.09444.6663NM_080391PTP4A2hsa_circ_104821hsa_circ_00018750.00880.09454.6515NM_014612FAM120Ahsa_circ_102659hsa_circ_00533940.00250.07434.6373NM_015955MEMO1hsa_circ_102658hsa_circ_00073850.00750.09304.5642NM_015955MEMO1hsa_circ_101985hsa_circ_00074560.01930.11594.5488NM_003010MAP2K4hsa_circ_087856hsa_circ_00878560.04170.15314.5160NM_002874RAD23Bhsa_circ_404714-0.04170.15304.4960NM_002189IL15RAhsa_circ_407116-0.02400.12404.4723NM_014673EMC2hsa_circ_033149hsa_circ_00331490.01040.09734.4556NM_032233SETD3hsa_circ_104533hsa_circ_00830920.00410.08204.4522NM_053043RBM33hsa_circ_007168hsa_circ_00071680.00360.08054.4332NM_182765HECTD2hsa_circ_100355hsa_circ_00146140.02460.12494.3998NM_004632DAP3hsa_circ_001810hsa_circ_00018100.00240.07264.3771NM_006540NCOA2hsa_circ_404041-0.01670.11084.3601NM_002865RAB2Ahsa_circ_005640hsa_circ_00056400.01310.10404.3385NR_036541GPR89Ahsa_circ_102713hsa_circ_00009970.03500.14344.3228NM_018079SRBD126 南京医科大学硕士学位论文续表3AcircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_104708hsa_circ_00024830.00680.09064.3065NM_005607PTK2hsa_circ_104820hsa_circ_00052180.00800.09394.2987NM_014612FAM120Ahsa_circ_104938hsa_circ_00074260.01170.10014.2897NM_015033FNBP1hsa_circ_103230hsa_circ_00634190.02830.13174.2473NM_000026ADSLhsa_circ_402265-0.01370.10444.2292NM_006296VRK2hsa_circ_057074hsa_circ_00570740.00520.08514.2250NM_003642HAT1hsa_circ_101277hsa_circ_00076100.00580.08774.2164NM_005358LMO7hsa_circ_001481hsa_circ_00014810.01370.10444.2163NM_198449EMBhsa_circ_102525hsa_circ_00505180.02020.11774.1938NM_005499UBA2hsa_circ_033475hsa_circ_00334750.04300.15504.1682NM_002376MARK3hsa_circ_104823hsa_circ_00875400.01060.09814.1489NM_014612FAM120Ahsa_circ_103312hsa_circ_00012780.01670.11084.1388NM_178862STT3Bhsa_circ_006973hsa_circ_00069730.01840.11454.1078NM_015009PDZRN3hsa_circ_405869-0.02140.12014.1069ENST00000459690PPM1Bhsa_circ_104812hsa_circ_00073510.01970.11674.1029NM_015239AGTPBP1hsa_circ_104706hsa_circ_00059820.00530.08624.0997NM_005607PTK2hsa_circ_101276hsa_circ_00082590.01340.10444.0819NM_005358LMO7hsa_circ_104913hsa_circ_00025440.02310.12314.0692NM_020946DENND1Ahsa_circ_101983hsa_circ_00056030.00250.07364.0668NM_003010MAP2K4hsa_circ_103109hsa_circ_00612740.00580.08784.0316NM_003489NRIP1hsa_circ_102630hsa_circ_00032870.01250.10204.0301NM_015909NBAShsa_circ_104658hsa_circ_00045920.00370.08104.0203NM_006281STK3hsa_circ_088478hsa_circ_00884780.01730.11224.0165NM_020946DENND1Ahsa_circ_102711hsa_circ_00544060.03120.13664.0160NM_002706PPM1B27 南京医科大学硕士学位论文续表3AcircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_104689hsa_circ_00018240.00710.09154.0151NM_018482ASAP1hsa_circ_102503hsa_circ_00009210.00610.08944.0138NM_003796URI1hsa_circ_100421hsa_circ_00063240.04220.15384.0127NM_144977DENND1Bhsa_circ_405509-0.01980.11693.9963NM_001201407ZNF778hsa_circ_100414hsa_circ_00079050.04910.16423.9918NM_005819STX6hsa_circ_104141hsa_circ_00016150.00870.09443.9792NM_017934PHIPhsa_circ_103229hsa_circ_00028110.00310.07693.9715NM_000026ADSLhsa_circ_100540hsa_circ_00176280.00380.08153.9547NM_001018039SFMBT2hsa_circ_102524hsa_circ_00505160.01920.11593.9532NM_005499UBA2hsa_circ_085048hsa_circ_00850480.01700.11163.9489NM_006281STK3hsa_circ_104233hsa_circ_00783620.01040.09733.9371NM_014892SCAF8hsa_circ_100320hsa_circ_00087340.01510.10723.9118NR_036541GPR89Ahsa_circ_103449hsa_circ_00022360.00180.07103.9097NM_012430SEC22Ahsa_circ_103045hsa_circ_00011470.01110.09903.8964NM_004902RBM39hsa_circ_101748hsa_circ_00036450.01720.11213.8952NM_020314C16orf62hsa_circ_100216hsa_circ_00082020.00830.09423.8705NM_019073SPATA6hsa_circ_103044hsa_circ_00048700.02630.12793.8695NM_004902RBM39hsa_circ_102135hsa_circ_00448750.00280.07663.8621NM_030938VMP1hsa_circ_065807hsa_circ_00658070.01030.09733.8532NM_005778RBM5hsa_circ_100230hsa_circ_00090760.00130.06673.8226NM_002525NRD1hsa_circ_005067hsa_circ_00050670.00900.09453.8028ENST00000602889RP11-84A19.4hsa_circ_104690hsa_circ_00089340.00640.08993.7771NM_018482ASAP1hsa_circ_102653hsa_circ_00074390.02330.12313.7742NM_002709PPP1CBhsa_circ_104634hsa_circ_00846150.01370.10443.7619NM_004318ASPH28 南京医科大学硕士学位论文续表3AcircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_102712hsa_circ_00055420.01220.10153.7454NM_018079SRBD1hsa_circ_052648hsa_circ_00526480.00390.08203.7436NM_001278276E2F6hsa_circ_101504hsa_circ_00021510.02920.13323.7432NM_005313PDIA3hsa_circ_104640hsa_circ_00018060.02900.13283.7395NM_024790CSPP1hsa_circ_005328hsa_circ_00053280.00570.08773.7313NM_006775QKI表3B.乳腺癌中表达下调的前100个circRNAsTable3B.Thetop100down-regulatedcircRNAsinbreastcancercircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_406225-0.03150.137312.4059NR_104314TAMM41hsa_circ_404724-0.02070.118612.1543NM_014241HACD1hsa_circ_406697-0.00830.09439.1299NM_018047RBM22hsa_circ_002873hsa_circ_00028730.01280.10308.9083NM_001310CREBL2hsa_circ_008842hsa_circ_00088420.04270.15458.8600NM_153695ZNF367hsa_circ_047418hsa_circ_00474180.01800.11377.4765NM_012319SLC39A6hsa_circ_401033-0.03380.14157.3711NM_004075CRY1hsa_circ_001288hsa_circ_00009990.02230.12187.3206NR_104182LOC100506142hsa_circ_104858hsa_circ_00878970.02540.12676.8909NM_032012TMEM245hsa_circ_001838hsa_circ_00002490.03670.14616.8752ENST00000539909ADKhsa_circ_404389-0.04400.15666.3184NM_198450APOOLhsa_circ_051778hsa_circ_00517780.03670.14616.3121NM_001190BCAT2hsa_circ_001130hsa_circ_00011300.03770.14806.3014NM_021156TMX4hsa_circ_100302hsa_circ_00135870.01810.11416.2802NM_014813LRIG2hsa_circ_404825-0.03740.14746.1481NM_173575STK32C29 南京医科大学硕士学位论文续表3BcircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_103561hsa_circ_00686690.04250.15435.8873NM_152699SENP5hsa_circ_000031hsa_circ_00000090.03760.14805.5856ENST00000378536SKIhsa_circ_403658-0.02890.13275.5784NM_015021ZNF292hsa_circ_404776-0.01530.10755.5685NM_145170CFAP70hsa_circ_101945hsa_circ_00413920.02720.12945.5532NM_017575SMG6hsa_circ_006054hsa_circ_00060540.00730.09235.4739NM_014686KIAA0355hsa_circ_406821-0.02490.12575.4532NM_032131ARMC2hsa_circ_019252hsa_circ_00192520.03990.15035.1472NM_020992PDLIM1hsa_circ_101531hsa_circ_00354450.01400.10475.1371NM_003888ALDH1A2hsa_circ_102850hsa_circ_00010810.00100.06415.1330NM_025000DCAF17hsa_circ_100822hsa_circ_00221680.03070.13615.0897NM_015457ZDHHC5hsa_circ_400102hsa_circ_00923540.03070.13595.0734ENST00000298532SNAPC4hsa_circ_400019hsa_circ_00923420.02080.11875.0734ENST00000314138RPL27Ahsa_circ_402583-0.01390.10445.0704NM_015568PPP1R16Bhsa_circ_006909hsa_circ_00069090.02590.12745.0629NM_015106RAD54L2hsa_circ_405283-0.00030.04925.0158NR_104113LINC00618hsa_circ_406796-0.02170.12055.0086NM_012123MTO1hsa_circ_009503hsa_circ_00095030.03030.13525.0021NM_181865ACOT7hsa_circ_069821hsa_circ_00698210.00000.03085.0014NM_020722KIAA1211hsa_circ_102504hsa_circ_00503860.00070.05874.9185NM_032139ANKRD27hsa_circ_007273hsa_circ_00072730.01920.11594.9169NM_015470RAB11FIP5hsa_circ_404685-0.00030.04724.8993NM_002508NID1hsa_circ_103818hsa_circ_00722790.00060.05864.8192NM_004298NUP155hsa_circ_101727hsa_circ_00006790.02510.12604.7716NM_004996ABCC130 南京医科大学硕士学位论文续表3BcircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_102922hsa_circ_00584290.01810.11394.7698NM_152386SGPP2hsa_circ_102086hsa_circ_00440130.03850.14894.7648NM_138387G6PC3hsa_circ_405395-0.03120.13664.7363NM_020843SCAPERhsa_circ_001954hsa_circ_00019540.04230.15384.7320NM_004654USP9Yhsa_circ_009502hsa_circ_00095020.02480.12544.6684NM_007274ACOT7hsa_circ_060539hsa_circ_00605390.01370.10444.6669NM_002999SDC4hsa_circ_002699hsa_circ_00026990.04320.15534.6551uc003vii.1METhsa_circ_401239-0.01500.10724.6488NM_014315KLHDC2hsa_circ_035410hsa_circ_00354100.02110.11964.6085NM_017661ZNF280Dhsa_circ_407224-0.02150.12034.5432NM_153366SVEP1hsa_circ_101004hsa_circ_00003750.00530.08594.5398NM_080730IFFO1hsa_circ_001978hsa_circ_00019030.02800.13074.5293NR_002975SNORA43hsa_circ_404996-0.03790.14854.5000NM_033114ZCRB1hsa_circ_000592hsa_circ_00005480.01280.10304.4685ENST00000342745KIAA0247hsa_circ_405177-0.02700.12924.4641ENST00000376279PCCAhsa_circ_400780-0.00200.07104.4598NM_002335LRP5hsa_circ_100519hsa_circ_00174120.01310.10424.4535NM_015155LARP4Bhsa_circ_000468hsa_circ_00004680.00070.05874.3965NM_153371LNX2hsa_circ_000544hsa_circ_00005440.00740.09294.3489NM_022495PCNXL4hsa_circ_100041hsa_circ_00050390.04030.15094.2471NM_012102REREhsa_circ_006855hsa_circ_00068550.01730.11224.2391NM_006473TAF6Lhsa_circ_103890hsa_circ_00071580.01540.10774.2079NM_015566FAM169Ahsa_circ_066950hsa_circ_00669500.03720.14704.2078NM_199420POLQhsa_circ_103448hsa_circ_00670290.03380.14154.1913NM_006810PDIA531 南京医科大学硕士学位论文续表3BcircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_100446hsa_circ_00001820.01570.10844.1869NM_014053FLVCR1hsa_circ_103224hsa_circ_00633290.00060.05874.1797NM_006386DDX17hsa_circ_000186hsa_circ_00001860.00180.07104.1662ENST00000344507MIA3hsa_circ_000346hsa_circ_00003460.01010.09704.1577ENST00000525775RP11-113K21.2hsa_circ_103331hsa_circ_00040300.01850.11464.0865NM_001098209CTNNB1hsa_circ_001082hsa_circ_00007920.03420.14224.0622ENST00000579003MIR142hsa_circ_001596hsa_circ_00015960.00630.08994.0549NM_005322HIST1H1Bhsa_circ_404831-0.00110.06484.0290NM_012305AP2A2hsa_circ_407257-0.02390.12394.0068ENST00000344894NDOR1hsa_circ_100270hsa_circ_00130620.02600.12744.0002NM_153259MCOLN2hsa_circ_104050hsa_circ_00755040.01770.11263.9896NM_015482SLC22A23hsa_circ_001420hsa_circ_00014440.00060.05863.9852ENST00000442267TBC1D9hsa_circ_100499hsa_circ_00040390.03260.13913.8839NM_000254MTRhsa_circ_079381hsa_circ_00793810.01300.10363.8687NM_018106ZDHHC4hsa_circ_405727-0.00900.09453.8618ENST00000325495HNRNPMhsa_circ_404876-0.01130.09923.8503NM_012194KIAA1549Lhsa_circ_000950hsa_circ_00015250.00070.05873.8466ENST00000337752C5orf56hsa_circ_001363hsa_circ_00001720.01580.10863.8356ENST00000340006CSRP1hsa_circ_103279hsa_circ_00080270.04920.16423.8033NM_002542OGG1hsa_circ_076482hsa_circ_00764820.00490.08363.7939ENST00000230419PTK7hsa_circ_006718hsa_circ_00067180.01610.10943.7586NM_018294CWF19L1hsa_circ_404599-0.02730.12963.7565ENST00000294785NCSTNhsa_circ_090650hsa_circ_00906500.03630.14533.7470NM_004493HSD17B10hsa_circ_100460hsa_circ_00029240.00460.08303.7358NM_012414RAB3GAP232 南京医科大学硕士学位论文续表3BcircRNAs别称PFDRFC转录本基因记号hsa_circ_004097hsa_circ_00040970.00410.08203.6845NM_031912SYT15hsa_circ_101253hsa_circ_00300450.02170.12053.6321NM_014252SLC25A15hsa_circ_405248-0.00940.09593.6208NM_020806GPHNhsa_circ_102331hsa_circ_00472850.02730.12963.6019NM_153211TTC39Chsa_circ_005634hsa_circ_00056340.00080.06093.5890NM_183006DLGAP4hsa_circ_012123hsa_circ_00121230.00090.06283.5820uc001clf.3ATP6V0Bhsa_circ_100430hsa_circ_00071670.03150.13733.5453NM_001684ATP2B4hsa_circ_104038hsa_circ_00753930.04330.15543.5410NM_006098GNB2L1hsa_circ_002659hsa_circ_00026590.00500.08443.5363NM_001164458ACTR3Chsa_circ_104091hsa_circ_00760400.02000.11723.5313NM_000841GRM4hsa_circ_100239hsa_circ_00126730.01470.10653.5189NM_014762DHCR24hsa_circ_102415hsa_circ_00073760.02070.11873.5100NM_030662MAP2K2hsa_circ_100219hsa_circ_00046190.00280.07663.5099NM_007051FAF1FDR，阳性结果错误率；FC，差异倍数2.1.5聚类分析对芯片筛选的差异circRNAs进行无监督聚类分析，并绘制热图。芯片筛选的差异circRNAs可以将乳腺癌癌组织和癌旁组织正确的区分开来。如图4所示，红色表示高的相对表达量，绿色表示低的相对表达量。33 南京医科大学硕士学位论文图4.差异表达circRNAs的热图Figure4.HeatmapofdifferentiallyexpressedcircRNAs2.2组织中差异表达的circRNA初步验证2.2.1qRT-PCR验证依据circRNA芯片结果，使用以下标准筛选差异表达的circRNA用于验证，①长度在200-3000bp左右；②FC>2；③P<0.01；④原始强度>200；⑤外显子相关的circRNA（便于后续功能验证）。共筛选出6个候选circRNAs，包括三个表达上调的circRNAs（hsa_circ_103110、hsa_circ_104689和hsa_circ_104821），和三个表达下调的circRNAs（hsa_circ_006054、hsa_circ_100219和hsa_circ_406697）。熔解曲线显示所有引物都具有很好的特异性（图5）。以GAPDH为内参，纳入51对癌组织和癌旁组织进行qRT-PCR验证。根据Ct算法，hsa_circ_103110，hsa_circ_104689和hsa_circ_104821在乳腺癌组织中表达上调（P<0.05），hsa_circ_006054，hsa_circ_100219和hsa_circ_406697在乳腺癌组织中表达下调（P<0.05）。qRT-PCR验证结果与芯片结果一致（图6）。34 南京医科大学硕士学位论文图5.差异表达circRNAs的溶解曲线Figure5.MeltingcurvesofdifferentiallyexpressedcircRNAs35 南京医科大学硕士学位论文hsa_circ_103110hsa_circ_104689hsa_circ_10482115P=0.018015P=0.041915P=0.0311101010555RelativeexpressionlevelRelativeexpressionlevelRelativeexpressionlevel000TNTNTNhsa_circ_006054hsa_circ_100219hsa_circ_4066972515P<0.000125P<0.0001P=0.041820201015151010555RelativeexpressionlevelRelativeexpressionlevelRelativeexpressionlevel000TNTNTN图6.通过qRT-PCR验证乳腺癌和癌旁组织中的circRNAsFigure6.ValidationofnovelcircRNAsbyqRT-PCRinbreastcancerandadjacentnormal-appearingtissues2.2.2异常调节的circRNAs与乳腺癌临床特征的关系进一步分析年龄、免疫组化结果（ER、PR、HER-2）、肿瘤大小和淋巴结转移情况与差异circRNAs间的关系，结果发现孕激素受体阴性（PR-）与hsa_circ_104689，hsa_circ_104821的表达上调相关，与hsa_circ_406697的表达下调相关（表4）。2.2.3单个或者组合circRNA作为乳腺癌生物标志物的价值分析通过绘制ROC曲线，进一步评估6个circRNAs对乳腺癌的诊断价值。使用中位数为截断值将circRNAs表达量分为2类（低、高），结果发现，hsa_circ_100219具有最高的诊断准确性，AUC为0.78（95％CI：0.69-0.88），灵敏度为0.69(0.54-0.81)，特异度为0.71(0.56-0.83)（表5）。考虑到circRNAs之间的联合作用，发现当联合应用6个circRNAs时，AUC为0.82（95％CI：0.74-0.91）（图7）。36 南京医科大学硕士学位论文表4.乳腺癌组织中circRNAs表达水平与临床病理特征的关联分析Table4.TherelationshipbetweencircRNAsexpressionlevels(ΔCt)andclinicopathologicalcharacteristicsofpatientswithbreastcancer特征Hsa_circ_103110Hsa_circ_104689Hsa_circ_104821Hsa_circ_006054Hsa_circ_100219Hsa_circ_406697mean±SDPmean±SDPmean±SDPmean±SDPmean±SDPmean±SDP年龄(岁)≤608.79±2.160.9158.09±2.270.2496.15±1.580.68615.92±1.790.22110.16±1.570.84815.04±2.430.493>608.85±1.337.43±1.085.96±1.5415.27±1.8310.07±1.6414.58±2.02ERpositive9.02±1.330.4298.17±2.150.2386.21±1.420.55415.41±1.910.33310.07±1.480.81814.44±2.720.200negative8.58±2.317.51±1.635.94±1.6915.91±1.7210.18±1.7015.27±1.64PR***positive8.53±1.280.3398.61±2.420.0386.72±1.450.03915.04±1.840.07010.02±1.520.72113.70±2.600.005negative9.00±2.137.42±1.465.75±1.5216.01±1.7310.19±1.6415.51±1.78HER2positive8.63±1.850.4188.09±2.060.2376.30±1.470.21415.45±1.710.3309.82±1.460.08414.76±2.340.727negative9.06±1.867.42±1.635.72±1.6515.97±1.9610.62±1.6814.99±2.2037 南京医科大学硕士学位论文续表4特征Hsa_circ_103110Hsa_circ_104689Hsa_circ_104821Hsa_circ_006054Hsa_circ_100219Hsa_circ_406697mean±SDPmean±SDPmean±SDPmean±SDPmean±SDPmean±SDP肿瘤大小T18.87±1.400.3878.00±1.440.3006.25±1.660.84815.30±2.120.45810.01±1.640.79814.46±2.800.563T28.98±1.937.97±2.156.03±1.5715.93±1.6910.25±1.6315.14±2.12T37.32±2.636.57±1.485.82±1.9915.21±1.469.80±1.3514.34±1.11a淋巴结*N08.64±1.790.3417.79±2.120.0316.32±1.400.29515.67±1.720.78310.46±1.400.20914.92±2.210.832N18.64±1.668.57±1.626.14±1.8415.47±2.099.56±1.6914.61±2.75N29.70±2.326.53±1.235.35±1.7616.00±1.6610.25±1.7615.15±1.41ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；HER2：人类表皮生长因子受体；SD：标准差。a：node分期中没有N3样本。未收集到关于肿瘤转移数据Metastasis。38 南京医科大学硕士学位论文表5.特异性circRNA在乳腺癌中的诊断价值研究Table5.DiagnosticvaluesofspecificcircRNAsinbreastcancerCircRNAsaAUC(95%CI)灵敏度(95%CI)特异度(95%CI)截断值hsa_circ_1031100.63(0.52-0.74)0.63(0.48-0.76)0.63(0.48-0.76)8.97hsa_circ_1046890.61(0.50-0.73)0.57(0.42-0.71)0.55(0.40-0.69)7.67hsa_circ_1048210.60(0.49-0.71)0.57(0.42-0.71)0.57(0.42-0.71)6.04hsa_circ_0060540.71(0.61-0.81)0.65(0.50-0.78)0.69(0.54-0.81)14.84hsa_circ_1002190.78(0.69-0.88)0.69(0.54-0.81)0.71(0.56-0.83)8.95hsa_circ_4066970.64(0.52-0.75)0.63(0.48-0.76)0.63(0.48-0.76)14.24aAUC:areaunderthecurve;:采用中位数计算截断值。图7.联合应用hsa_circ_006054，hsa_circ_100219和hsa_circ_406697诊断乳腺癌的ROC曲线Figure7.TheROCcurveofthecombinationofhsa_circ_006054,hsa_circ_100219andhsa_circ_406697forthediagnosisofbreastcancer39 南京医科大学硕士学位论文2.3血浆qRT-PCR初步验证选择在组织中验证有统计学意义的circRNAs，在血浆样本中进行进一步验证。共纳入42对乳腺癌患者血浆和正常对照的血浆样本进行qRT-PCR。结果发现，乳腺癌患者和正常对照血浆中的hsa_circ_103110，hsa_circ_104689和hsa_circ_104821可检出，但差异没有统计学意义（表6）。hsa_circ_006054，hsa_circ_100219和hsa_circ_406697等血浆中含量极低，在血浆中未检出或仅少部分样本能够检出。表6.乳腺癌患者血浆和正常对照血浆中circRNAs的表达值Table6.ExpressionanddiagnosticvalueofspecificcircRNAsinbreastcancera表达水平CircRNAstP病例血浆对照血浆hsa_circ_1031103.38±1.843.85±1.821.420.16hsa_circ_1046893.99±2.084.36±1.881.150.26hsa_circ_1048214.13±1.794.23±1.760.290.78a:circRNAs的表达根据ΔCt计算方法求得均数±标准差。2.4细胞系qRT-PCR初步验证对组织验证有差异的circRNAs，在乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468）和乳腺正常上皮细胞(MCF-10A)中进行验证，发现hsa_circ_104821在三种乳腺癌细胞系中表达均上调（P<0.01）（图8）。40 南京医科大学硕士学位论文图8.通过qRT-PCR验证乳腺癌细胞系和乳腺正常上皮细胞系的circRNAsFigure8.ValidationofnovelcircRNAsbyqRT-PCRinbreastcancercellsandbreastepithelialcells41 南京医科大学硕士学位论文3讨论CircRNA可能由外显子或内含子序列产生，起着miRNA海绵、剪接和转录调节因子以及亲本基因表达调节因子的作用。既往研究表明，circRNAs在癌组[54][59][60]织中表达具有差异，如基底细胞癌、胃癌、宫颈癌、非小细胞性肺癌[61][57]和乳腺癌等中存在差异表达的circRNAs。也有研究表明，在疾病状态下血浆circRNA的表达水平发生改变，通过分析差异表达的circRNA有助于进一[62]步了解疾病的发病机制，进行疾病风险预测。本研究利用circRNA芯片技术和qRT-PCR技术，对乳腺癌癌灶组织和癌旁组织中差异表达的circRNAs进行筛选和验证。基于芯片初筛结果，选择6个候选circRNAs（hsa_circ_103110、hsa_circ_104689、hsa_circ_104821、hsa_circ_006054、hsa_circ_100219和hsa_circ_406697）进行初步验证，并探讨了这6个差异circRNAs的表达与乳腺癌患者临床指标的关联性和作为乳腺癌生物标志物的价值。CircRNA芯片检测结果显示，在乳腺癌癌组织和癌旁组织中，共有1155个差异表达的circRNAs。利用对qRT-PCR对6个候选circRNAs进行验证结果显示，hsa_circ_103110、hsa_circ_104689和hsa_circ_104821在乳腺癌组织中表达上调，hsa_circ_006054、hsa_circ_100219和hsa_circ_406697在乳腺癌组织中下调，芯片结果和qRT-PCR验证结果一致。Hsa_circ_103110（也被称命名为hsa_circ_0004771），由人核受体相互作用蛋白1基因（NRIP1）编码。一项GWAS研究发现，NRIP1与乳腺癌发生风险[63][64]相关。H.Aziz等发现用7,12-二甲基苯并[a]蒽（DMBA）处理野生型小鼠，可以促进NRIP1的表达，同时，NRIP1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞中过表达。抑制NRIP1的表达可以促进细胞凋亡和抑制细胞生长。NRIP1的蛋白质产物可[65]刺激雌激素受体的转录活性并且在乳腺癌的疾病进程中起关键作用。NRIP1可能是乳腺癌的潜在治疗靶点。既往研究发现，该circRNA在人类乳头状甲状[66][67]腺癌中表达上调，在胃癌病人血浆中表达下调。Hsa_circ_104689从具有SH3结构域，锚蛋白重复序列和PH结构域1的42 南京医科大学硕士学位论文[68]ArfGAP基因(ASAP1)剪接而来。ASAP1可以编码与结肠直肠癌、喉鳞状细[69]胞癌的癌蛋白。乳腺癌中ASAP1表达与癌细胞的增殖和转移有关，可作为治疗乳腺癌的靶点。Hsa_circ_104821源自具有序列相似性的家族120A基因(FAM120A),其编码的蛋白质可以激活FAK和PI3K信号通路，与结肠癌转移有关[70]。Hsa_circ_006054来源于KIAA0355基因,该基因编码一个不典型的蛋白质，[71]可能参与结直肠癌的发生和发展。Hsa_circRNA_100219来源于Fas相关因子1(FAF1),其编码的蛋白质和FAS抗原结合，起到启动或增强细胞凋亡的作用。FAF1也可作为肿瘤抑制剂,异常的FAF1表达可以减少癌细胞体外迁移和体内侵[72]袭/转移。Hsa_circ_406697来源于RNA结合基序蛋白22（RBM22）。RBM22[73,74]编码的RNA结合蛋白在细胞分裂中发挥作用，可能参与前体mRNA剪接。分层分析显示，孕激素受体阴性（PR-）与hsa_circ_104689，hsa_circ_104821的表达上调相关，与hsa_circ_406697的表达下调相关。提示组织circRNA的表达水平可能受到乳腺癌病程中某些临床指标的影响，但本研究未发现其他临床指标显著影响组织circRNA的表达水平。本研究利用ROC曲线分析差异表达的circRNAs作为乳腺癌诊断用生物标志物的价值。结果表明hsa_circ_100219的诊断价值较高，AUC为0.78（95％CI：0.69-0.88），灵敏度为0.69(0.54-0.81)，特异度为0.71(0.56-0.83)。考虑单一circRNA作为生物标志物往往价值有限，多种circRNA组合可克服单一指标所带来的缺点。我们将6个差异表达的circRNA进行了不同的组合，当联合应用6个circRNAs，AUC增加到0.82（95％CI：0.74-0.91）。发展乳腺癌诊断技术具有非常重要的临床意义和社会经济效益。有研究者发现，结直肠癌病人血清中存在67个circRNA缺失，新产生了257个在正常人血清中不存在的circRNA，并发现circ-KLDHC10的表达在结直肠癌病人与正常人血清外泌体中存在差异[62]。但目前尚未见有关血浆circRNA作为乳腺癌生物标志物的报道。本研究对乳腺癌组织中表达有差异的6个circRNAs在血浆样43 南京医科大学硕士学位论文本中进行了检测，结果未发现有统计学意义的差异circRNAs。Hsa_circ_006054，hsa_circ_100219和hsa_circ_406697在血浆中未检出，这可能与其表达水平相对较低以及检测方法灵敏度的限制有关。44 南京医科大学硕士学位论文第二部分乳腺癌相关circRNAs的功能预测分析随着生物信息技术的发展，科学家们利用生物信息学软件预测靶基因并对其功能进行注释分析，从而得到有效的信息是全面分析乳腺癌分子机制的关键。GO和KEGG通路分析可以探讨circRNA调控疾病发病机制与相关信号通路，如KEGG通路分析显示子痫前期病人中circRNAs主要富集于凋亡，Wnt信号传[75]导通路和HIF-1信号通路，这为疾病的病因诊断和治疗提供理论基础。最新[28,76]的证据表明，circRNA可以通过与miRNA结合，调节靶基因的表达，例[77]如，circRNACdr1as，也被称为CiRS-7，可以作为miR-7的“海绵体”。在乳腺癌细胞中，circ-ABCB10通过与miR-1271结合促进乳腺癌发生和发展[78]。本部分基于癌组织和癌旁组织qRT-PCR验证结果，采用生物信息学方法，分析癌组织和癌旁组织中差异表达的circRNAs可能结合的miRNAs，采用GO和KEGG通路分析，系统地从circRNA调控的角度探讨乳腺癌可能的发病机制，为以后的研究提供理论依据。1村料与方法1.1样本来源对乳腺癌组织和癌旁组织中差异表达的6个circRNAs（详见第一部分）进行生物信息学分析。1.2基因本体论（GeneOntology，GO）分析GO分析是基因功能国际标准分类体系，分为生物过程（biologicalprocess,BP）、分子功能（molecularfunction,MF）和细胞组分（cellularcomponent,CC）三部分。在circRNA芯片检测出差异表达circRNAs后，使用topGO进行芯片结果中差异表达circRNAs的GO分析，以推断它们参与的BP、MF和CC，45 南京医科大学硕士学位论文并计算差异基因的P值和FDR值，以P<0.05为标准筛选显著性的差异基因。1.3KEGGPathway分析KEGGPathway根据分子参与的功能，以PathwayMap形式展示每个通路中基因（蛋白质）、小分子等网络。基于最新的KEGG数据库（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)，对芯片结果中差异表达的circRNAs进行通路分析，以推断它们参与的生物学途径，利用Fisher精确检验，对差异表达circRNAs参与的生物学通路进行显著性分析，计算生物学通路的FisherP值和FDR值，以FisherP<0.05为标准筛选显著性的生物学通路。1.4circRNA/miRNA结合位点分析使用Arraystar的自制miRNA靶基因预测软件预测5个高匹配值的miRNA结合位点。miRNA靶基因预测软件对circRNA/miRNA相互做了详细的注释。利用miRNA靶基因预测软件TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microrna.org/)进行的分析。2结果2.1差异表达circRNAs的GO分析为了探讨circRNA如何调控亲本基因转录，我们对在乳腺癌组织中差异表达的circRNAs的靶向基因进行了GO富集分析。富集最大的BP为：乳腺癌组织中表达上调的circRNAs主要富集在单生物发育过程、解剖结构发育、发育过程等，乳腺癌组织中表达下调的circRNAs主要富集在跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、系统发育、单一生物体发育过程等。在MF方面，乳腺癌组织中表达上调的circRNAs主要富集在“细胞质”、“细胞内部分”、“细胞内”，乳腺癌组织中表达下调的circRNAs主要富集在“突触”、“突触部分”、“细胞连接”等。在CC方面，乳腺癌组织中表达上调的circRNAs主要富集在“蛋白质结合”、“结合”、“序列特异性DNA结合”，乳腺癌组织中表达下调的circRNAs主要富集在“蛋白质结合”、“离子通道抑制剂活性”、“通道抑制剂活性”等。图9A和9B分别显示了乳腺癌组织中表达上调和下调的circRNAs在BP、MF和CC中富集得分46 南京医科大学硕士学位论文前10位GO条目。图9.差异表达circRNAs的GO分析Figure9.GOanalysisofthebiologicalfunctionsofcircRNAtargetgenes2.2差异表达circRNAs的KEGGpathway分析KEGG分析显示，乳腺癌组织中表达上调的circRNAs主要与致心律失常性右心室心肌病、肥厚型心肌病、粘连与连接等有关，Hippo信号通路和WNT信号通路等途径也与表达上调的circRNA有关（图10A）。乳腺癌组织中表达下调47 南京医科大学硕士学位论文的circRNAs主要与可卡因上瘾、Rap1信号通路、粘连与连接等有关（图10B）。图10.差异表达circRNAs的KEGG分析Figure10.KEGGanalysisofthebiologicalfunctionsofcircRNAtargetgenes2.3circRNA与miRNA的关联分析我们对每个差异表达的circRNAs预测5个高匹配值的miRNAs结合位点（表7）。通过文献检索，我们发现这些可以与circRNAs结合的miRNAs与乳腺癌相关。对以下miRNA-circRNA相互作用进行了详细的注释，如hsa-miR-339_5p和hsa_circ_103110；hsa-miR-143-5p和hsa_circ_104689；hsa-miR-409-3p/hsa-miR-153-3p/hsa-miR-145-5p和hsa_circ_104821；hsa-miR-298/hsa-miR-485-3p和hsa_circ_100219；hsa-miR-100-3p和48 南京医科大学硕士学位论文hsa_circ_406697（详见图11）。图11.circRNA/miRNA相互作用的详细注释Figure11.DetailedannotationofcircRNA/miRNAinteractions49 南京医科大学硕士学位论文表7.差异表达的circRNAs预测的靶miRNAsTable7ThedifferentiallyexpressedcircRNAsandtargetedmiRNAsCircRNAs别称(circBase)MiRNA1MiRNA2MiRNA3MiRNA4MiRNA5hsa_circ_103110hsa_circ_0004771hsa-miR-653-5phsa-miR-339-5phsa-miR-330-5phsa-miR-595hsa-miR-629-3phsa_circ_104689hsa_circ_0001824hsa-miR-627-3phsa-miR-143-5phsa-miR-656-3phsa-miR-376a-5phsa-miR-222-5phsa_circ_104821hsa_circ_0001875hsa-miR-409-3phsa-miR-153-3phsa-miR-145-5phsa-miR-9-5phsa-miR-152-3phsa_circ_006054hsa_circ_0006054hsa-miR-5001-3phsa-miR-718hsa-miR-4793-3phsa-miR-4524a-5phsa-miR-513a-5phsa_circ_100219hsa_circ_0004619hsa-miR-135b-3phsa-miR-298hsa-miR-485-3phsa-miR-182-5phsa-miR-593-5phsa_circ_406697-hsa-miR-6873-3phsa-miR-6833-3phsa-miR-6845-3phsa-miR-6742-5phsa-miR-100-3p50 南京医科大学硕士学位论文3讨论研究表明，circRNA主要通过与miRNA的相互作用发挥重要的生物学调控功[76]能，然而，多数已发现的circRNA的功能及其在疾病发生中的作用机制尚不完全清楚。本研究在前期二阶段实验研究的基础上，针对乳腺癌差异性表达circRNAs，借助GO分析和KEGG通路分析，对异常表达的circRNA的生物过程以及所参与的生物学通路进行初步分析，为后期的功能预测和机制探讨提供信息。结合qRT-PCR验证结果，应用Arraystar软件预测circRNA可能结合的miRNA，并对circRNA/miRNA相互作用的详细注释。GO分析结果显示，乳腺癌组织中异常表达的circRNAs主要参与单生物发育过程和解剖结构发育和跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号过程；KEGG通路分析结果显示，乳腺癌组织中异常表达的circRNAs参与多条癌症相关信号通路，如Hippo信号通路、WNT信号通路、RAP1信号通路和RAS信号通路等。Hippo信号通路[79]可以调节miRNA的合成，可能与癌症中miRNA广泛下调有关。异常的WNT信号传导是人类各种病变的基础，是最典型的癌症相关信号通路之一，WNT信[80]号传导通路可以控制所有动物在发育和成年生活中的生物学现象。1982年，研究人员在小鼠乳腺肿瘤内第一次发现前癌基因Wnt1。Schlange等研究显示，干[81]扰人乳腺癌的自分泌Wnt信号可降低乳腺癌细胞的增殖与活力。RAP1信号通[82]路对于血管形成和血管发生的主要过程是非常重要的。转移性乳腺癌的小鼠模型通常具有突变的癌蛋白，可激活RAS信号传导，RAS通路激活与ERα（+）乳腺癌患者生存率降低紧密相关，RAS信号通路是乳腺癌转移扩散的关键决定因[83]素。近年来，有学者提出circRNA可作为一种ceRNA假说，即circRNA可以作为miRNA的“海绵体”，通过对miRNA的结合原件竞争性地吸附miRNA，进而影响miRNA对下游靶基因的调控。目前研究较多的是小脑变性相关蛋白反义转录物（antisensetothecerebellardegeneration-relatedprotein1transcript，CDR1as）。circRNACdr1as（也被称为CiRS-7），有74个miR-7结合位点，已被证明在斑马鱼中脑的发育中能竞争性抑制miR-7活性，上调靶基因的表达水平，CDR1as/miR-751 南京医科大学硕士学位论文[28,76]轴可能参与肿瘤相关生物学过程。既往研究表明，癌症相关miRNA如hsa-miR-339-5p、hsa-miR-143-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-153-3p和[84-88]hsa-miR-145-5p在乳腺癌中表达下调。生物信息学表明这些miRNA可以与乳腺癌组织中上调的circRNA匹配。其他乳腺癌相关miRNAs，如hsa-miR-298、hsa-miR-485-3p和hsa-miR-100，与我们研究中发现的表达下调的circRNA相匹配[89-91]。总之，circRNAs可参与癌症相关信号通路，并可以结合多个癌症相关miRNAs，可能与乳腺癌的发生发展有关。有关乳腺癌的circRNA研究仍处于起步阶段，功能分析还不够完善，在未来研究中应该加入更多实验的研究来改善这些缺点，例如circRNA敲除或过表达的研究将有利于进一步探讨乳腺癌中circRNA对miRNA的抑制作用，荧光素酶报告系统研究可以进一步验证circRNA与miRNA的结合作用。52 南京医科大学硕士学位论文参考文献：[1]ChenW,ZhengR,BaadePD,ZhangS,ZengH,BrayF,JemalA,YuXQ,HeJ.CancerstatisticsinChina,2015.CACancerJClin,2016,66(2):115-132.[2]BarnardME,BoekeCE,TamimiRM.Establishedbreastcancerriskfactorsandriskofintrinsictumorsubtypes.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-ReviewsonCancer,2015,1856(1):73-85.[3]PhippsAI,BuistDS,MaloneKE,BarlowWE,PorterPL,KerlikowskeK,O'MearaES,LiCI.Breastdensity,bodymassindex,andriskoftumormarker-definedsubtypesofbreastcancer.AnnEpidemiol,2012,22(5):340-348.[4]PollanM,AscunceN,EderraM,MurilloA,ErdozainN,Ales-MartinezJ,Pastor-BarriusoR.Mammographicdensityandriskofbreastcanceraccordingtotumorcharacteristicsandmodeofdetection:aSpanishpopulation-basedcase-controlstudy.BreastCancerRes,2013,15(1):R9.[5]LiCI,BeaberEF,TangMT,PorterPL,DalingJR,MaloneKE.Reproductivefactorsandriskofestrogenreceptorpositive,triple-negative,andHER2-neuoverexpressingbreastcanceramongwomen20-44yearsofage.BreastCancerResTreat,2013,137(2):579-587.[6]FejermanL,AhmadiyehN,HuD,HuntsmanS,BeckmanKB,CaswellJL,TsungK,JohnEM,Torres-MejiaG,Carvajal-CarmonaL,EcheverryMM,TuazonAM,RamirezC,ConsortiumC,GignouxCR,EngC,Gonzalez-BurchardE,HendersonB,LeMarchandL,KooperbergC,HouL,AgalliuI,KraftP,LindstromS,Perez-StableEJ,HaimanCA,ZivE.Genome-wideassociationstudyofbreastcancerinLatinasidentifiesnovelprotectivevariantson6q25.NatCommun,2014,5:5260.[7]LindstromS,ThompsonDJ,PatersonAD,LiJ,GierachGL,ScottC,StoneJ,DouglasJA,dos-Santos-SilvaI,Fernandez-NavarroP,VerghaseJ,SmithP,BrownJ,LubenR,WarehamNJ,LoosRJ,HeitJA,PankratzVS,NormanA,GoodeEL,CunninghamJM,deAndradeM,VierkantRA,CzeneK,FaschingPA,BagliettoL,SoutheyMC,GilesGG,ShahKP,ChanHP,HelvieMA,BeckAH,KnoblauchNW,HazraA,HunterDJ,KraftP,PollanM,FigueroaJD,CouchFJ,HopperJL,HallP,EastonDF,BoydNF,VachonCM,TamimiRM.Genome-wideassociationstudyidentifiesmultiplelociassociatedwithbothmammographicdensityandbreastcancerrisk.NatCommun,2014,5:5303.[8]PalombaG,LoiA,PorcuE,CossuA,ZaraI,BudroniM,DeiM,LaiS,MulasA,OlmeoN,IontaMT,AtzoriF,CuccuruG,PitzalisM,ZoledziewskaM,OllaN,LovicuM,PisanoM,AbecasisGR,UdaM,TandaF,MichailidouK,EastonDF,ChanockSJ,HooverRN,HunterDJ,SchlessingerD,SannaS,53 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南京医科大学硕士学位论文Chang-ClaudeJ,ChoiJY,ClaesKB,ClarkeC,CoxA,CrossSS,CzeneK,DalyMB,delaHoyaM,DeLeeneerK,DevileeP,DiezO,DomchekSM,DoodyM,DorflingCM,DorkT,Dos-Santos-SilvaI,DumontM,DwekM,DworniczakB,EganK,EilberU,EinbeigiZ,EjlertsenB,EllisS,FrostD,LallooF,Embrace,FaschingPA,FigueroaJ,FlygerH,FriedlanderM,FriedmanE,GambinoG,GaoYT,GarberJ,Garcia-ClosasM,GehrigA,DamiolaF,LesueurF,MazoyerS,Stoppa-LyonnetD,behalfofGSC,GilesGG,GodwinAK,GoldgarDE,Gonzalez-NeiraA,GreeneMH,GuenelP,HaeberleL,HaimanCA,HallbergE,HamannU,HansenTV,HartS,HartikainenJM,HartmanM,HassanN,HealeyS,HogervorstFB,VerhoefS,Hebon,HendricksCB,HillemannsP,HollestelleA,HulickPJ,HunterDJ,ImyanitovEN,IsaacsC,ItoH,JakubowskaA,JanaviciusR,Jaworska-BieniekK,JensenUB,JohnEM,JolyBeauparlantC,JonesM,KabischM,KangD,KarlanBY,KauppilaS,KerinMJ,KhanS,KhusnutdinovaE,KnightJA,KonstantopoulouI,KraftP,KwongA,LaitmanY,LambrechtsD,LazaroC,LeMarchandL,LeeCN,LeeMH,LesterJ,LiJ,LiljegrenA,LindblomA,LophatananonA,LubinskiJ,MaiPL,MannermaaA,ManoukianS,MargolinS,MarmeF,MatsuoK,McGuffogL,MeindlA,MenegauxF,MontagnaM,MuirK,MulliganAM,NathansonKL,NeuhausenSL,NevanlinnaH,NewcombPA,NordS,NussbaumRL,OffitK,OlahE,OlopadeOI,OlswoldC,OsorioA,PapiL,Park-SimonTW,Paulsson-KarlssonY,PeetersS,PeisselB,PeterlongoP,PetoJ,PfeilerG,PhelanCM,PresneauN,RadiceP,RahmanN,RamusSJ,RashidMU,RennertG,RhiemK,RudolphA,SalaniR,SangrajrangS,SawyerEJ,SchmidtMK,SchmutzlerRK,SchoemakerMJ,SchurmannP,SeynaeveC,ShenCY,ShrubsoleMJ,ShuXO,SigurdsonA,SingerCF,SlagerS,SoucyP,SoutheyM,SteinemannD,SwerdlowA,SzaboCI,TchatchouS,TeixeiraMR,TeoSH,TerryMB,TessierDC,TeuleA,ThomassenM,TihomirovaL,TischkowitzM,TolandAE,TungN,TurnbullC,vandenOuwelandAM,vanRensburgEJ,VendenBergD,VijaiJ,Wang-GohrkeS,WeitzelJN,WhittemoreAS,WinqvistR,WongTY,WuAH,YannoukakosD,YuJC,PharoahPD,HallP,Chenevix-TrenchG,KconFab,InvestigatorsA,DunningAM,SimardJ,CouchFJ,AntoniouAC,EastonDF,ZhengW.Identificationofindependentassociationsignalsandputativefunctionalvariantsforbreastcancerriskthroughfine-scalemappingofthe12p11locus.BreastCancerRes,2016,18(1):64.[51]ZhangB,Beeghly-FadielA,LongJ,ZhengW.Geneticvariantsassociatedwithbreast-cancerrisk:comprehensiveresearchsynopsis,meta-analysis,andepidemiologicalevidence.TheLancetOncology,2011,12(5):477-488.[52]SangerHL,KlotzG,RiesnerD,GrossHJ,KleinschmidtAK.Viroidsare57 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南京医科大学硕士学位论文A,SchmutzlerRK,Muller-MyhsokB,LichtnerP,Chang-ClaudeJ,HeinR,NickelsS,Flesch-JanysD,TsimiklisH,MakalicE,SchmidtD,BuiM,HopperJL,ApicellaC,ParkDJ,SoutheyM,HunterDJ,ChanockSJ,BroeksA,VerhoefS,HogervorstFB,FaschingPA,LuxMP,BeckmannMW,EkiciAB,SawyerE,TomlinsonI,KerinM,MarmeF,SchneeweissA,SohnC,BurwinkelB,GuenelP,TruongT,Cordina-DuvergerE,MenegauxF,BojesenSE,NordestgaardBG,NielsenSF,FlygerH,MilneRL,AlonsoMR,Gonzalez-NeiraA,BenitezJ,Anton-CulverH,ZiogasA,BernsteinL,DurCC,BrennerH,MullerH,ArndtV,StegmaierC,JustenhovenC,BrauchH,BruningT,Wang-GohrkeS,EilberU,DorkT,SchurmannP,BremerM,HillemannsP,BogdanovaNV,AntonenkovaNN,RogovYI,KarstensJH,BermishevaM,ProkofievaD,KhusnutdinovaE,LindblomA,MargolinS,MannermaaA,KatajaV,KosmaVM,HartikainenJM,LambrechtsD,YesilyurtBT,FlorisG,LeunenK,ManoukianS,BonanniB,FortuzziS,PeterlongoP,CouchFJ,WangX,StevensK,LeeA,GilesGG,BagliettoL,SeveriG,McLeanC,AlnaesGG,KristensenV,Borrensen-DaleAL,JohnEM,MironA,WinqvistR,PylkasK,Jukkola-VuorinenA,KauppilaS,AndrulisIL,GlendonG,MulliganAM,DevileeP,vanAsperenCJ,TollenaarRA,SeynaeveC,FigueroaJD,Garcia-ClosasM,BrintonL,LissowskaJ,HooningMJ,HollestelleA,OldenburgRA,vandenOuwelandAM,CoxA,ReedMW,ShahM,JakubowskaA,LubinskiJ,JaworskaK,DurdaK,JonesM,SchoemakerM,AshworthA,SwerdlowA,BeesleyJ,ChenX,MuirKR,LophatananonA,RattanamongkongulS,ChaiwerawattanaA,KangD,YooKY,NohDY,ShenCY,YuJC,WuPE,HsiungCN,PerkinsA,SwannR,VelentzisL,EcclesDM,TapperWJ,GertySM,GrahamNJ,PonderBA,Chenevix-TrenchG,PharoahPD,LathropM,DunningAM,RahmanN,PetoJ,EastonDF.Genome-wideassociationanalysisidentifiesthreenewbreastcancersusceptibilityloci.NatGenet,2012,44(3):312-318.[64]AzizMH,ChenX,ZhangQ,DeFrainC,OslandJ,LuoY,ShiX,YuanR.SuppressingNRIP1inhibitsgrowthofbreastcancercellsinvitroandinvivo.Oncotarget,2015,6(37):39714-39724.[65]AugereauP,BadiaE,FuentesM,RabenoelinaF,CorniouM,DerocqD,BalaguerP,CavaillesV.TranscriptionalregulationofthehumanNRIP1/RIP140genebyestrogenismodulatedbydioxinsignalling.MolPharmacol,2006,69(4):1338-1346.[66]PengN,ShiL,ZhangQ,HuY,WangN,YeH.MicroarrayprofilingofcircularRNAsinhumanpapillarythyroidcarcinoma.PLoSOne,2017,12(3):e0170287.[67]LiT,ShaoY,FuL,XieY,ZhuL,SunW,YuR,XiaoB,GuoJ.PlasmacircularRNAprofilingofpatientswithgastriccancerandtheirdropletdigital59 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南京医科大学硕士学位论文cancerisregulatedbymiR-298.AmJPathol,2012,180(6):2490-2503.[91]Anaya-RuizM,BandalaC,Perez-SantosJLM.miR-485ActsasaTumorSuppressorbyInhibitingCellGrowthandMigrationinBreastCarcinomaT47DCells.AsianPacificJournalofCancerPrevention,2013,14(6):3757-3760.62 南京医科大学硕士学位论文综述环状RNA在疾病中的研究进展摘要：环状RNA（circularRNA,circRNA）是一大类具有调节功能的非编码RNA，具有分布广泛、结构稳定、丰度高和组织特异性等特征。circRNA的形成模式最主要的是套锁驱动的环化和内含子配对驱动的环化。circRNA作为miRNA的“海绵体”，可结合miRNA，通过调节miRNA实现对靶基因表达的调控。circRNA与各种疾病，尤其是肿瘤的发生发展密切相关。本对circRNA的形成模式、功能及其与人类疾病的关系进行综述，旨在更好地了解疾病的发病机制，为疾病筛查诊断以及治疗提供新思路。关键词：非编码RNA；环状RNA；疾病ResearchProgressofcircRNAsinHumanDiseasesAbstractCircularRNAs(circRNAs)arealargeclassofnon-codingRNAswithregulatorypotency.Theyoftenexhibittissue/developmental-stagespecificexpressionpatternswithhighabundance.TheformationofcircRNAsincludeslariat-drivencircularizationandintron-pairing-drivencircularization.CircRNAs,functioningasmircoRNAsponges,canindirectlymodulateexpressionofmostmRNAs.CircRNAsplayanimportantroleinthedevelopmentsofhumandiseases,especiallyincancer,nervoussystemdisease,musculoskeletaldisease,cardiovasculardisease.Inthisreview,wefocusonthebiogenesisandfunctionofcircRNAsandtheirpotentialrolesinhumandiseases,withaimstoexplorethemechanismsofdiseasesandprovideanewdirectionforthescreening,predictingandtreatment.Keywords:Non-codingRNA;CircRNA;Disease63 南京医科大学硕士学位论文非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA）是不能编码蛋白质的RNA，包括miRNA、siRNA、piRNA、lncRNAs以及circRNA等，曾经被认为是“垃圾序列”而一度受到忽视。随着研究的不断深入，人们发现ncRNA其实具有许多重要功[1]能，可以参与细胞生长、胚胎形成、基因调节、信号传导、受体激活等过程。ncRNA也可以通过调控mRNA的翻译过程而调节特定基因的表达，最终影响疾[2,3]病的发生。环状RNA（circularRNA,circRNA）是区别于传统mRNA的一类新型的具[4]有调节能力的非编码RNA，具有组织和发育阶段特异性。circRNA最早于20世纪70年代在RNA病毒中被发现，但在过去的30余年里，一度被认为是一类[5]由外显子转录本发生错误剪接而形成的低丰度RNA分子。随着RNA高通量检测技术和生物信息学的发展，人们发现circRNA在不同物种中普遍存在且具[4,6]有重要的生理功能。与mRNA的典型剪接不同，circRNA通过反向剪接形[7]成一个无5’端帽子和3’尾巴的闭合环状结构，不易受RNA外切酶的影响。circRNA具有许多的功能，其中最为突出的是具有miRNA海绵作用或者作为竞争性内源性RNA（competingendogenousRNA，ceRNA），通过调控miRNA靶[4]基因而发挥作用。本文主要介绍circRNA的形成模式、功能以及与人类疾病的关系，探讨circRNA在临床中的应用潜能。1.circRNA的形成模式与mRNA的典型剪接不同，circRNA通过反向剪接形成，且形成模式具有多样性，主要有以下五种模式。第一，套锁驱动的环化(lariat-drivencircularization)（图1.1），套索驱动的环化由一个外显子3’端的剪接供体(splicedonor)和另一个外显子5’端的剪接受体(spliceacceptor)共价结合,然后在剪接体的作用下去除内[7]含子而形成，这是一种特殊的反剪接反应。第二，内含子配对驱动的环化(intron-pairing-drivencircularization)（图1.2），通过ALU重复序列（ALUrepeat64 南京医科大学硕士学位论文sequence）互补或者其他RNA二级结构，使得2个内含子通过碱基互补配对结合，[7]然后切去内含子而形成。内含子配对驱动的环化也可形成保留内含子的外显子环化circRNA——外显子内含子环化的circRNA（exonintroncircRNAs，[8]EIciRNAs），然而EIciRNAs形成的机制还不明确。第三，研究者发现盲肌结合蛋白（muscleblindprotein,MBL）可以作为RNA结合蛋白（RNA-bindingprotein，RBP）与circMbl以及其侧翼内含子结合，RBP在侧翼内含子之间建立一个桥梁，[9,10]促进circRNA或者EIciRNAs的生成（图1.3）。在一定条件下，RBP在circRNA[11]形成过程中可以作为促进剂或者抑制剂，如Quaking促进circRNA的形成，而[12]RNA编辑酶（RNA-editingenzyme，ADAR1）抑制circRNA的形成。第四，[13]针对内含子来源的circRNA研究较少，Zhang等在人类细胞中发现内含子环化的RNA（circularintronicRNAs,ciRNA），ciRNA的形成要求5’剪接位点富含7-ntGU序列，分枝点富含11-ntC序列（图1.4）。第五，最新的研究发现癌症相关染[14]色体异位，可能产生融合circRNA（fusion-circRNAs,f-circRNAs）（图1.5）。现阶段对circRNA的形成机制仍不完全清楚，有必要对circRNA的形成机制做更进一步的研究。2.circRNA的功能circRNA可以作为miRNA的海绵体，调节亲代基因的表达，参与蛋白质的翻译以及与RBPs结合等。2.1作为miRNA“海绵体”发挥作用现有的研究已经证实miRNA几乎与所有的细胞功能相关，影响疾病发生发[15]展。CircRNA富含miRNA应答原件（microRNAresponseelement，MRE），[4,在细胞中起到miRNA海绵体的作用，可以解除miRNA对其靶基因的调控作用16]（图2.1）。circRNA通过与miRNA的相互作用，与生理功能调节和人类疾病有关，如睾丸特异性circRNA（sexdeterminingregionY，Sry），具有16个miR-138[16,结合位点，可通过与miR-138的相互结合影响人体多种生理学和病理学过程17]。如小脑变性相关蛋白反义转录物（antisensetothecerebellar65 南京医科大学硕士学位论文degeneration-relatedprotein1transcript，CDR1as或者称ciRS-7），有74个miR-7[4,16]结合位点，可通过与miR-7的相互结合参与疾病相关生物学过程。郝臻凤等发现ciRS-7可以竞争性结合miR-7，调节FAK通路，促进宫颈癌细胞的増殖、[18]侵袭及转移。2.2调控亲代基因的表达[19]位于细胞核的包含内含子的circRNA，可以调控基因转录过程。cicRNAs大量存在于细胞核中，可以与聚合酶II（PolII）结合，调节宿主转录活性。如锚蛋白重复结构域52（ci-ankyrinrepeatdomain52，ci-ankrd52）是来源于ci-ankrd52的ciRNAs，可以影响RNAPolII复合体的延长，是PolII复合体的[13]正调节因子，对其亲代基因发挥正向调控作用。EIciRNA通常富集在启动子区，通过特殊的RNA-RNA结合方式与小核核糖体蛋白U1snRNP结合形成EIciRNA-U1snRNP复合体，复合体可以与PolII结合，通过正向调控作用增强[8]其亲代基因转录能力（图2.2）。2.3circRNA的其他功能在circRNA启动子上游插入一个内部核糖体进入位点（internalribosome[20]entrysite，IRES），circRNA也能翻译蛋白质。将一个包含绿色荧光蛋白开放阅读框的环状mRNA导入大肠杆菌，在大肠杆菌体内可以检测到绿色荧光蛋白[21]。然而到目前为止，只在丁型肝炎病毒中发现了能翻译蛋白质的circRNA分[22]子。circRNA通过与阿格蛋白（argonaute，AGO）紧密结合，或直接与其他RNA配对，影响mRNA的转录和翻译；也可以逆转录产生假基因，影响细胞分[19,23]化和肿瘤进展。这些研究表明，在未来几年，识别circRNA更多的功能和对circRNA功能的诠释是circRNA研究领域的热点。3．环状RNA在疾病中的研究进展3.1circRNA与肿瘤的关系人类肿瘤的发病原因和发生机制复杂，寻找特异性生物标志物是肿瘤生物学研究的重要方向。许多circRNA具有组织及发育阶段特异性，一些circRNA66 南京医科大学硕士学位论文[24]对肿瘤的发生和发展起到重要的调节作用。有研究者应用芯片或测序技术对癌组织样本及对应的癌旁组织中circRNA的表达谱进行分析，发现异常表达现[25,26]象在肿瘤中普遍存在。circRNA在肿瘤中异常表达与肿瘤类型及其发生发展密切关联。通过circRNA芯片在乳腺癌癌组织和癌旁组织中检测到1155个差异表达的circRNAs。通过qRT-PCR实验发现，乳腺癌发现hsa_circ_100219在乳腺癌和正[27]常对照样本中表达具有差异性，且对乳腺癌诊断具有较高的诊断价值，提示circRNA可能与乳腺癌发病相关。有研究者发现，hsa_circ_0001649在肝癌组织中显著下调（n=89），其表达水平与肿瘤大小相关。Hsa_circ_0001649通过结合miRNA（如miR-1283，miR-4310，miR-182-3p，miR-888-3p，miR-4502，miR-6811，miR-6511b-5p和miR-1972等），调控基因表达，可能与肝癌的发生和转移有关[28][29]。Li等在684对食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织的研究中发现，cir-ITCH在食管鳞状细胞癌组织中表达显著下调。circRNA的表达丰度在结直肠癌细胞系和结直肠癌癌组织中均低于正常组织，癌组织中cir-ITCH和hsa_circ_001988的[30-32]表达量显著下降。此外，研究者在人类血清外泌体中发现大量完整而稳定的circRNA，且circRNA表达谱在癌症患者血清中和正常人中存在很大差异。与正常组织相比，结直肠癌病人血清中有67个circRNA缺失，同时新产生了257个在正常人血清中不存在的circRNA，并发现circ-KLDHC10的表达在结直肠癌[33]病人与正常人血清外泌体中存在差异。在白血病病人的研究中发现f-circRNA可以促进细胞增殖和过度增殖，具有促癌作用；在白血病小鼠模型中，[14]f-circM9可以促进肿瘤的发展且具有一定的耐药作用。circRNA作为miRNA的海绵体可调节肿瘤相关通路，目前研究较多的是CDR1as。CDR1as可以自然捕获和抑制miR-7的活性，促进肿瘤基因，如表皮生长因子（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）和胰岛素受体底物2（insulinreceptorsubstrate-2，IRS2）的表达，也可以抑制抑癌基因的表达，如核转录因子[26,34]（Krüppel-likefactor4，KLF4），与宫颈癌、乳腺癌和肝癌等有关。此外，67 南京医科大学硕士学位论文miR-7通过靶向局灶黏附斑激酶（focaladhesionkinase，FAK）和胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactor1receptor，IGF1R）间接上调E-降钙素，抑制上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT），延缓肿瘤的生长和转[35]移。cir-ITCH作为miR-7，miR-1和miR-214的海绵体，可以上调ITCH的水平，ITCH高表达可以促进泛素化和磷酸化降解Dvl2，从而抑制典型的Wnt信号通路，[36,37]而Wnt通路的失控与肝癌、卵巢癌以及食管癌的发生有密切联系。Yang等[38]发现circ-ITCH在膀胱癌组织和细胞系中下调，低circ-ITCH表达的膀胱癌患者生存期缩短。circ-ITCH的高表达可以抑制细胞在体外和体内的增殖，迁移，侵袭和转移。同时，circ-ITCH通过“海绵状”（与miR-17和miR-224结合）上调miR-17和miR-224靶基因p21和PTEN的表达，抑制了膀胱癌的侵袭性生物学行为。3.2circRNA与神经系统疾病在果蝇体内，具有神经调节功能的基因通常具有较长的内含子区域，同时可以表达相对较高水平的circRNA；在人类大脑中，circRNA水平高于相应的线[12,39]性RNA，这些发现对circRNA与神经系统疾病的研究具有重要意义。[40][41]Rybak-Wolf等和You等报导了上千种存在于哺乳动物大脑中的保守circRNA，与相应的线性RNA亚型相比，这些circRNA多数在神经形成时表达上调，在突触联合过程中富集。在不同鼠组织中发现，circRNA在神经纤维网中的富集程度超过mRNA且可以调节突触的功能，这些circRNA部分来自编码突[42]触蛋白的宿主基因。Lin等通过建立葡萄糖剥夺/再复氧（oxygen-glucosedeprivation/reoxygenation，OGD/R）的HT22细胞模型，发现mmu-circRNA-015947的表达在HT22细胞模型高于HT22正常细胞，这表明circRNA表达改变可能与OGD/R诱发神经损伤有关。miR-7作为α-突触核蛋白和泛素化蛋白连接酶A（ubiquitinproteinligaseA，UBE2A）的调节剂，与神经退行性疾病存在直接关联。circRNA调节的[43]miRNA-mRNA系统可能是疾病的一种表观控制方式。在斑马鱼中表达人68 南京医科大学硕士学位论文[4]CDR1as和敲除miR-7，均可导致斑马鱼中脑体积减小；阿尔茨海默病患者的受损脑细胞中CDR1as的缺乏提高了miR-7的水平，最终抑制miR-7靶基因的[44]表达，如UBE2A。UBE2A是一个自噬泡，可以清除淀粉酶，但在阿尔茨海[45]默病和其他中枢神经系统进行性炎症退化疾病中被耗尽。Kumar等使用阿尔茨海默病的转基因秀丽隐杆线虫模型，circzip-2可能通过结合miR-60，从而在与阿尔茨海默病有关的各种疾病进程中发挥重要作用。circRNA表达的特异性和稳定性，使他们在神经系统疾病中具有重要的研究价值，circRNA在神经系统中的机制需进一步的研究。3.3circRNA与心血管系统疾病的关系circRNA在心脏分化过程中特异性激活的途径中发挥关键作用。circRNA控[46]制心脏分化，这可能在调控异常时引起心脏相关疾病。Lei等探索了人诱导多能干细胞（hiPSCs）和hiPSC衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）中的circRNA谱，在hiPSC和hiPSC-CM中共鉴定了5602个circRNA。分化的心肌细胞中circRNA的表达比未分化的hiPSC更为丰富。circSLC8A1、circCACNA1D、circSPHKAP和circALPK2等circRNAs在心脏分化过程中表现出心脏特异性表达，并且在胎儿心脏组织中特异性富集，可以充当心肌细胞的生物标志物。circSLC8A1在患有扩张型心肌病的患者的心脏组织中异常增加，可能是心脏病的病理状态指征。心脏相关circRNA（heart-relatedcircRNA，HRCR）作为miR-223海绵体可以抑制心脏肥大和心力衰竭，miR-223转基因小鼠易发生心脏肥大和心力衰竭，而miR-223缺失的小鼠没有相应病症。研究发现了包含HRCR、miR-223和ARC[47]的心脏肥大调控模式，这条通路可能是心脏肥大和心力衰竭治疗的靶点。[48]Burd等在动脉粥样硬化心血管疾病（atheroscleroticvasculardisease，ASVD）中发现circRNA转录本环状反义非编码RNA（circularantisensenoncodingRNAintheINK4locus，cANRIL）。人类全基因组关联研究分析显示，INK4/ARF基因座附近的染色体9p21.3单核苷酸多态性（SNPs）与ASVD易感性相关。基因INK4/ARF可被多梳家族（Polycomb-groupproteins，PcG）复合物抑制，而cANRIL69 南京医科大学硕士学位论文可通过特异的PcG募集来抑制INK4/ARF的表达，间接调控ASVD的发生。Siede[49]等使用人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）来鉴定心脏发育和疾病中的circRNA和宿主基因动力学。RNA-seq和qRT-PCR数据显示，circRNA表达在hiPSC-CM模型中是具有高度的活力的，同时也发现circMYOD、circSLC8A1、circATXN7和circPHF21A可以与核糖体或Argonaute2蛋白复合物相互作用。总之，hiPSC-CM模型揭示了潜在疾病相关的circRNA的新标签，可以作为新的治疗靶标。3.4circRNA与其他疾病的关系[50]circRNA可能与矽肺的发生相关。Yang等使用来自健康供体和患者的肺泡巨噬细胞的原代培养物和RAW264.7巨噬细胞系来研究circZC3H4在巨噬细胞活化中的功能。结果发现，SiO2同时增加了circZC3H4的表达和ZC3H4蛋白水平的增加，SiO2激活的巨噬细胞通过circZC3H4RNA/ZC3H4途径促进成纤维细胞增殖和迁移，从而提供了ZC3H4应用于治疗矽肺的研究新方向。[51]circRNA还可能与伤口愈合相关。Yang等发现环状RNAcirc-Amotl1的表达在小鼠切除伤口模型中可以加速伤口愈合过程。异常表达的circ-Amotl1增加了Stat3和Dnmt3a的蛋白质水平。表达上调的Dnmt3a和Stat3可以促使miR-17的启动子区甲基化，降低miR-17-5p水平，增加纤连蛋白表达。所有这些过程都可能导致细胞粘附，迁移，增殖，存活和伤口修复增加。此外，我们发现circ-Amotl1不仅增加了Stat3的表达，而且促进了Stat3核易位。因此，异位表达circ-Amotl1和Stat3主要易位至细胞核。circ-Amotl1可以加速伤口修复，可在临床上为皮肤伤口愈合提供新希望。在一项巢式病例对照研究中，先兆子痫患者血细胞中hsa_circ_101222的水平高于健康对照人群。研究者将血浆蛋白因子endogin与circRNA结合起来，为先兆子痫患者创建一个新的早期预测模型，结果发现hsa_circ_101222和endogin[52]的共同作用可以提高对先兆子痫的预测价值（ROC曲线下面积AUC=0.876）。circRNA-miRNA-mRNA网络提示circRNA100783在CD28相关CD8（+）T细70 南京医科大学硕士学位论文[53]胞老龄化中可能参与调节磷蛋白相关信号传导。circRNA在疾病中的研究目前尚处于起步阶段。4．circRNA在疾病筛查、诊断和治疗中的应用和展望自2013年后，circRNA研究得到了快速发展。越来越多的研究表明，circRNA[24,40]具有普遍性、保守性、特异性、稳定性以及高丰度表达等特征，这些特征使circRNA相较于miRNA似乎更具有生物标志物和治疗靶点价值。与邻近正常组织相比，肿瘤组织中circRNA上调或者下调意味着circRNA可能与肿瘤的发生发展有关。多数circRNA的检测需要组织样本，在临床应用上有一定的困难。研究也发现circRNA在人体血液、血浆及外泌体中广泛存在。发现血液中[54]circRNA的表达水平高于肝脏组织和小脑组织；血清外泌体中circRNA的丰度高于癌症细胞系，肿瘤患者血清外泌体circRNA的富集程度与肿瘤的大小有[33]关，这些研究表明人外周血循环circRNA的改变与疾病发生发展关系密切，有望成为疾病筛查诊断和治疗的一种重要分子标志物。外周血检测具有低创伤性、操作便捷性，意味着外周血circRNA将具有更好的临床应用价值。circRNA为人类基因组“暗物质”的研究提供了新的视角。现阶段，circRNA在疾病发生发展中的生物学和分子学机制尚未清楚，但现有研究显示circRNA在人类疾病研究中可能具有更大的潜能。随着人们对circRNA重视程度的提高、RNA高通量技术和生物信息技术的发展，circRNA在人体生理学和病理学中的功能将被逐步揭开。成为一类新兴的肿瘤诊断、治疗和预后预测生物标志物。71 南京医科大学硕士学位论文参考文献：[1]PlaceRF,NoonanEJ.Non-codingRNAsturnuptheheat:anemerginglayerofnovelregulatorsinthemammalianheatshockresponse.CellStressChaperones,2014,19(2):159-172.[2]LiZ,EnderC,MeisterG,MoorePS,ChangY,JohnB.ExtensiveterminalandasymmetricprocessingofsmallRNAsfromrRNAs,snoRNAs,snRNAs,andtRNAs.NucleicAcidsRes,2012,40(14):6787-6799.[3]ZhangC,PengG.Non-codingRNAs:anemergingplayerinDNAdamageresponse.MutatResRevMutatRes,2015,763:202-211.[4]MemczakS,JensM,ElefsiniotiA,TortiF,KruegerJ,RybakA,MaierL,MackowiakSD,GregersenLH,MunschauerM,LoewerA,ZieboldU,LandthalerM,KocksC,leNobleF,RajewskyN.CircularRNAsarealargeclassofanimalRNAswithregulatorypotency.Nature,2013,495(7441):333-338.[5]CapelB,SwainA,NicolisS,HackerA,WalterM,KoopmanP,GoodfellowP,Lovell-BadgeR.Circulartranscriptsofthetestis-determininggeneSryinadultmousetestis.Cell,1993,73(5):1019-1030.[6]DananM,SchwartzS,EdelheitS,SorekR.Transcriptome-widediscoveryofcircularRNAsinArchaea.NucleicAcidsRes,2012,40(7):3131-3142.[7]JeckWR,SorrentinoJA,WangK,SlevinMK,BurdCE,LiuJ,MarzluffWF,SharplessNE.CircularRNAsareabundant,conserved,andassociatedwithALUrepeats.RNA,2013,19(2):141-157.[8]LiZ,HuangC,BaoC,ChenL,LinM,WangX,ZhongG,YuB,HuW,DaiL,ZhuP,ChangZ,WuQ,ZhaoY,JiaY,XuP,LiuH,ShanG.Exon-introncircularRNAsregulatetranscriptioninthenucleus.NatStructMolBiol,2015,22(3):256-264.[9]Ashwal-FlussR,MeyerM,PamudurtiNR,IvanovA,BartokO,HananM,EvantalN,MemczakS,RajewskyN,KadenerS.circRNAbiogenesiscompeteswithpre-mRNAsplicing.MolCell,2014,56(1):55-66.[10]LasdaE,ParkerR.CircularRNAs:diversityofformandfunction.RNA,2014,20(12):1829-1842.[11]ConnSJ,PillmanKA,ToubiaJ,ConnVM,SalmanidisM,PhillipsCA,RoslanS,SchreiberAW,GregoryPA,GoodallGJ.TheRNAbindingproteinquakingregulatesformationofcircRNAs.Cell,2015,160(6):1125-1134.[12]IvanovA,MemczakS,WylerE,TortiF,PorathHT,OrejuelaMR,PiechottaM,LevanonEY,LandthalerM,DieterichC,RajewskyN.AnalysisofintronsequencesrevealshallmarksofcircularRNAbiogenesisinanimals.CellRep,2015,10(2):170-177.[13]ZhangY,ZhangXO,ChenT,XiangJF,YinQF,XingYH,ZhuS,YangL,ChenLL.CircularintroniclongnoncodingRNAs.MolCell,2013,72 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南京医科大学硕士学位论文[41]YouX,VlatkovicI,BabicA,WillT,EpsteinI,TushevG,AkbalikG,WangM,GlockC,QuedenauC,WangX,HouJ,LiuH,SunW,SambandanS,ChenT,SchumanEM,ChenW.NeuralcircularRNAsarederivedfromsynapticgenesandregulatedbydevelopmentandplasticity.NatNeurosci,2015,18(4):603-610.[42]LinSP,YeS,LongY,FanY,MaoHF,ChenMT,MaQJ.CircularRNAexpressionalterationsareinvolvedinOGD/R-inducedneuroninjury.BiochemBiophysResCommun,2016,471(1):52-56.[43]LukiwWJ.CircularRNA(circRNA)inAlzheimer'sdisease(AD).FrontGenet,2013,4:307.[44]BingolB,ShengM.Deconstructionforreconstruction:theroleofproteolysisinneuralplasticityanddisease.Neuron,2011,69(1):22-32.[45]KumarL,Shamsuzzama,JadiyaP,HaqueR,ShuklaS,NazirA.FunctionalCharacterizationofNovelCircularRNAMolecule,circzip-2andItsSynthesizingGenezip-2inC.elegansModelofParkinson'sDisease.2018.[46]LeiW,FengT,FangX,YuY,YangJ,ZhaoZA,LiuJ,ShenZ,DengW,HuS.SignatureofcircularRNAsinhumaninducedpluripotentstemcellsandderivedcardiomyocytes.StemCellResTher,2018,9(1):56.[47]WangK,LongB,LiuF,WangJX,LiuCY,ZhaoB,ZhouLY,SunT,WangM,YuT,GongY,LiuJ,DongYH,LiN,LiPF.AcircularRNAprotectstheheartfrompathologicalhypertrophyandheartfailurebytargetingmiR-223.EurHeartJ,2016,37(33):2602-2611.[48]BurdCE,JeckWR,LiuY,SanoffHK,WangZ,SharplessNE.ExpressionoflinearandnovelcircularformsofanINK4/ARF-associatednon-codingRNAcorrelateswithatherosclerosisrisk.PLoSGenet,2010,6(12):e1001233.75 南京医科大学硕士学位论文5’3’12341）2）3）1供受41414体体碱基配对RBPRRBP2323232323或23EIciRNA2323circRNAcircRNA76 南京医科大学硕士学位论文4)5)Gene1Gene25’3’5’13’5’13’1212323Alu-XAlu-Y染色体异位12222ciRNAf-circRNA图1circRNA的形成模式1）套索驱动的环化，外显子13’的剪接供体和外显子45’的剪接受体共价联合形成外显子跳跃的套索环。2）内含子配对驱动的环化，内含子1和3通过碱基配对形成环状结构，内含子被移除形成circRNA，内含子被保留形成EIciRNA。3）RBP驱动的环化，RBP可以驱动侧翼内含子紧密连接，内含子被移除形成circRNA，内含子被保留形成EIciRNA。4）内含子环化形成ciRNA。5)融合circRNA来源于染色体异位。77 南京医科大学硕士学位论文1）2）2323miRNA海绵体RBP海绵体调控转录232323U1snRNPPolIIPromoterGene图2circRNA的功能1）circRNA可以作为miRNA的海绵体和RBP的海绵体。2）ciRNA与PolII结合，EIciRNA与U1snRNP结合形成EIciRNA-U1snRNP复合体，复合体与PolII结合，调控宿主基因转录。78 南京医科大学硕士学位论文附录一、英文缩略词表Abbreviation英文缩写英文全称中文全称AUCAreaunderthecurve曲线下面积BPBiologicalprocess生物过程CCCellularcomponent细胞组分ceRNAcompetitiveendogenousRNA竞争性内源性RNAcircRNAcircularRNA环状RNAFAF1Fasassociatedfactor1Fas相关因子1FAM120AFamilywithsequencesimilarity120A具有序列相似性的家族120AFCFoldchange差异倍数FDRFalsediscoveryrate误判率GAPDHGlyceraldehydephosphatedehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶GOGeneOntology基因本体论KEGGKyotoEncyclopediaofGeneandGenomes京都基因与基因组百科全书MFMolecularfunction分子功能MREMiRNAresponseelementmiRNA应答元件ncRNANon-codingRNA非编码RNANRIP1Nuclearreceptorinteractingprotein1人核受体相互作用蛋白1qRT-PCRquantitativereversetranscriptionpolymerasechain定量逆转录聚合酶链反应reactionRBM22RNAbindingmotifprotein22RNA结合基序蛋白22ROCReceiverOperatingCharacteristic受试者工作特征SNPsSingleNucleotidePolymorphisms单核苷酸多态79 南京医科大学硕士学位论文附录二、乳腺癌患者信息收集表1、编号：______________2、住院号：______________3、姓名：______________4、年龄：______________5、民族：______________6、家族史：______________7、月经状态：______________8、ER：______________9、PR：______________10、HER-2：______________11、TNM分期：______________12、肿瘤大小：______________13、分化程度：______________14、病理类型：______________15、组织学分级：______________16、阳性淋巴结个数：______________17、淋巴结转移：______________80 南京医科大学硕士学位论文附录三、硕士期间发表文章1.LvL,LiT,XuK,ShiP,HeB,KongW,WangJ,SunJ.Sputumbacteriologyconversionandtreatmentoutcomeofpatientswithmultidrug-resistanttuberculosis.Infectionanddrugresistance.2018;11:147-54.2.LüL,SunJ,ShiP,KongW,XuK,HeB,ZhangS,WangJ.IdentificationofcircularRNAsasapromisingnewclassofdiagnosticbiomarkersforhumanbreastcancer.Oncotarget.2017,8(27):44096-44107.3.PengX,XueH,LüL(并列一作),ShiP,WangJ,WangJ.Accumulatedpromotermethylationasapotentialbiomarkerforesophagealcancer.Oncotarget.2017Jan3;8(1):679-691.4.LüL,MaoX,ShiP,HeB,XuK,ZhangS,WangJ.MicroRNAsintheprognosisoftriple-negativebreastcancer:Asystematicreviewandmeta-analysis.Medicine(Baltimore).2017,96(22):e7085.5.吕玲双,王建明.环状RNA与人类疾病研究进展.医学研究杂志.2017;46(1):18-21.6.ShenY,PengX,WangM,ZhengX,XuG,LüL,XuK,BurstromB,BurstromK,WangJ.Familymember-basedsupervisionofpatientswithhypertension:aclusterrandomizedtrialinruralChina.JHumHypertens.2017Jan;31(1):29-36.7.YueJ,MaoX,XuK,LüL,LiuS,ChenF,WangJ.Prevalence,Awareness,TreatmentandControlofDiabetesMellitusinaChinesePopulation.PLoSOne.2016,11(4):e0153791.8.WangM,XuG,LüL,XuK,ChenY,PanH,BurstromB,BurstromK,WangJ.GeneticpolymorphismsofIL-17A,IL-17F,TLR4andmiR-146ainassociationwiththeriskofpulmonarytuberculosis.SciRep.2016,628586.9.ZhengX,MaoX,XuK,LüL,PengX,WangM,XuG,HuaZ,WangJ,XueH,WangJ,LuC.MassiveEndoscopicScreeningforEsophagealandGastricCancersinaHigh-RiskAreaofChina.PloSone.2015;10(12):e0145097.81 南京医科大学硕士学位论文致谢三年生活一晃而过，回首走过的岁月，心中倍感充实，当我写完这篇毕业论文的时候，有一种如释重负的感觉，感慨良多。首先，我要感谢我的导师，王建明教授。王老师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。王老师的寄语“受光于庭户见一堂，受光于天下照四方”，时刻提醒我要将个人的发展和国家民族的前途命运相连，用自己的力量温暖国家和社会。在此，谨向王老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！然后，我要感谢为本次研究提供无私帮助的宜兴市人民医院的各位老师，苏大附属医院的各位老师，镇江市第一人民医院的各位老师。你们的帮助促使我课题研究成为可能。你们认真的工作态度，深厚的专业知识使我对医学事业有了更深刻的理解。此外，我要感谢435这个大家庭里温文尔雅风度翩翩英俊潇洒风流倜傥智商超群的师兄师弟琨琨，以及活泼可爱天真无邪机智善良眉清目秀面若桃花师姐师妹们。非常幸运可以与你们在一个办公室生活学习。困难的时候有你们的帮助，开心的时候有你们的拥抱，挫折时有你们的鼓舞。正是有了你们，三年硕士研究生生活才那么丰富精彩。还有那些给我启发，支持我的老师同学朋友们，很高兴可以在研究生三年与这么可爱的你们相遇。最后，我要感谢的父母。感谢你们含辛茹苦的把我养育成人，感谢你们对我的理解、支持、鼓励和宠爱。你们是我的榜样，是我前行的灯塔，是我最坚强的后盾。我还要感谢英姿飒爽体魄健壮的弟弟，感谢你给了我无限的安全感。我爱你们。82