呼吸道合胞病毒与肺炎支原体，四型人冠状病毒流行病学分析及抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发

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分类号：R373.1密级：公开UDC：614.47编号：2014214550硕士学位论文呼吸道合胞病毒与肺炎支原体，四型人冠状病毒流行病学分析及抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发研究生：曾志奇导师：周荣教授申请学位级别：理学硕士年级：二零一四级学科专业：生物化学与分子生物学研究方向：医学病毒学论文提交日期：二零一七年五月论文答辩日期：二零一七年五月学位类型：学术型学位授予单位：广州医科大学答辩委员会主席：论文评阅人：二零一七年五月 硕士研究生学位论文呼吸道合胞病毒与肺炎支原体，四型人冠状病毒流行病学分析及抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发EpidemiologyofRespiratorySyncytialVirusandMycoplasmaPneumoniae,FourTypesofHumanCoronavirusandDevelopmentofHumanizedNeutralizingAntibodiesAgainstHumanAdenovirusType3姓名：曾志奇专业名称：生物化学与分子生物学导师：周荣教授导师单位：广州医科大学广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室广州医科大学·广州2017年5月 目录英文符号表.........................................................................................................................I中文摘要............................................................................................................................1前言................................................................................................................................7第一部分呼吸道合胞病毒与肺炎支原体流行病学分析..........................................14材料与方法...................................................................................................................14结果...............................................................................................................................16讨论...............................................................................................................................20结论...............................................................................................................................21第二部分四型人冠状病毒流行病学分析..................................................................22材料和方法...................................................................................................................22结果...............................................................................................................................25讨论...............................................................................................................................31结论...............................................................................................................................33第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发......................................................34材料与方法...................................................................................................................34结果...............................................................................................................................52讨论...............................................................................................................................64结论...............................................................................................................................67参考文献..........................................................................................................................68综述..................................................................................................................................74攻读研究生学位期间发表的论文..................................................................................83致谢..................................................................................................................................84学位论文独创性声明......................................................................................................85学位论文知识产权权属声明..........................................................................................85学位论文使用授权声明..................................................................................................85 英文符号表英文符号表英文缩写英文全称中文全称ARTIAcuterespiratorytractinfection急性呼吸道感染RSVRespiratorysyncytialvirus呼吸道合胞病毒MPMycoplasmapneumoniae肺炎支原体HCoVHumancoronavirus冠状病毒HAdv-3Humanadenovirustype3人3型腺病毒mAbMonoclonalantibody单克隆抗体PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应RT-PCRReal-timepolymerasechainreaction实时荧光定量PCRFluAInfluenzaAvirus甲型流感病毒FluBInfluenzaBvirus乙型流感病毒HBoVHumanbocavirus人类博卡病毒PIVParainfluenzavirus副流感病毒ADVAdenovirus腺病毒RSVRespiratorysyncytialvirus呼吸道合胞病毒HRVHumanrhinovirus鼻病毒HMPVHumanmetapneumovirus人类偏肺病毒CPChlamydiapneumoniae肺炎衣原体EVHumanmetapneumovirus肠道病毒TLR4Tolllikereceptor4Toll样受体INFInterferon干扰素HAMAHumananti-mouseantibody人抗鼠抗体CDRComplementaritydeterminingregion抗体互补决定区SDRSpecificity-determiningresidues特殊决定区EGFPEnhancedgreenfluorescentprotein增强型绿色荧光蛋白FBSFetalBovineSerum胎牛血清OSTEOsteonectin人骨粘连蛋白I 广州医科大学硕士学位论文PPTPropertrysin前胰蛋白酶HRPHorsereddishperoxidase辣根过氧化物酶Chemiluminescenceenzyme化学发光免疫分析方CLEIAimmunoassay法ADEAntibodydependentenhancement抗体依赖增强作用过氧化物酶—抗过氧PAPPeroxidase-anti-peroxidase化物酶法Plaquereductionneutralizationtest空斑减少中和实验PRNTPorcinereproductiveandrespiratory猪繁殖与呼吸综合征PRRSVsyndromevirus病毒II 中文摘要呼吸道合胞病毒与肺炎支原体，四型人冠状病毒流行病学分析及抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发研究生：曾志奇导师：周荣研究员（呼吸疾病国家重点实验室，广州医科大学附属第一医院，广州医科大学）中文摘要【目的】深入了解广州地区呼吸道合胞病毒(RSV)及肺炎支原体(MP)，四种不同亚型人冠状病毒的流行病学情况及临床特征，提高临床诊断的确诊率，并尝试对鼠源单克隆杂交瘤细胞株3D7的抗HAdv-3中和抗体基因进行人源化改造，为治疗性抗体的研发奠定基础。【方法】一、采集2012年1月～2014年1月期间在广州地区急性呼吸道疾病患儿(≤14岁)咽拭子标本，提取标本核酸，利用荧光定量PCR进行RSV与MP检测；并对其流行特征进行分析。二、采集2009年7月1日～2016年6月30日广州医科大学附属第一医院及中山大学孙逸仙纪念医院患有急性呼吸道感染的儿科住院患儿的咽拭子标本，共11399例。采用了荧光定量PCR方法对上述标本进行4种人类冠状病毒(Coronavirus,HCoV)检测，包括HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-OC43和HCoV-HKU1，随后取出人冠状病毒阳性标本进行11种常见呼吸道病毒检测。并对其流行特征进行分析。三、利用TRIzoL裂解分泌抗HAdv-3鼠源性单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株3D7提取全RNA，并通过逆转录为cDNA。利用多条特异性简并引物通过PCR扩增鼠源性mAb轻链和重链可变区基因。把鼠源性mAb轻链可变区基因及重链可变区基因分别克隆至Pa-L5(含人轻链信号肽及人轻链恒定区基因)构建L链，克隆至Pa-H2(含有人重链信号肽及人重链恒定区基因)构建H链，然后把L链通过基因扩增酶切克隆至Pc-DNA3.1(+)中，构建pcDNA3.1-3D7L载体，把H链通过基因扩增酶切克隆1 广州医科大学硕士学位论文至Pc-DNA3.1(+)中，构建pcDNA3.1-3D7H载体。把pcDNA3.1-3D7L与pcDNA3.1-3D7H质粒以1：1比例共同转染CHO-S细胞进行表达及构建稳定细胞系。【结果】一、在3760例患儿中，检出RSV392例，阳性率为10.4%；检出MP339例，阳性率9.0%。在RSV阳性病例中，年龄在0～9个月患儿最高，达19.6%(181/923例)。RSV流行高峰发生于2012年2月～4月和2013年1月～4月，阳性率分别为26.8%(136/507例)和18.0%(151/839例)。在MP阳性病例中，年龄在6～10岁阳性率最高，达20.1%(97/484例)，MP流行高峰发生在2012年7月～10月和2013年6月～10月，阳性率分别为16.3%(92/564例)和13.4%(124/922例)。在上呼吸道症状中，RSV感染患儿鼻塞[28.6%(112/392例)]、流涕[33.2%(130/392例)]发生率显著高于MP阳性患儿[15.0%(51/339例)、20.6%(70/339例)]，2组比较差异均有统计学意义(P均<0.001)；RSV感染患儿咳嗽[78.1%(306/392例)]、咳痰[20.4%(80/392例)]发生率显著低于MP阳性患儿[90.0%(305/339例)、27.1%(92/339例)]，2组比较差异均有统计学意义(P<0.001,P=0.032)。在下呼吸道症状中，RSV阳性患儿气喘[33.2%(130/392例)]、气促[13.5%(53/392例)]、喘鸣音[29.3%(115/392例)]、痰鸣音[18.9%(74/392例)]发生率显著高于MP阳性患儿[11.5%(39/339例)、6.5%(22/339例)、11.5%(39/339例)、10.6%(36/339例)]，2组比较差异均有统计学意义(P<0.001,P=0.002,P<0.001,P=0.002)。MP阳性患儿双肺呼吸音粗[59.2%(201/339例)]较RSV阳性患儿[40.1%(157/392例)]更为多见，2组比较差异有统计学意义(P<0.001)。二、总HCoV阳性率为4.3%(489/11399)，OC43阳性率为3.0%(346/11399)，229E阳性率为0.6%(65/11399)，NL63阳性率为0.5%(60/11399)，HKU1阳性率为0.3%(38/11399)，其中一些患儿存在共感染多型HCoV的情况。总HCoV阳性率在所有年龄组中在3.3%～5.5%之间。总HCoV和OC43在7~12个月的年龄段的患儿比例显著最高(p<0.001)。总HCoV、OC43、229E、NL63和HKU1阳性率最高的月份分别出现在2012年四月(15.3%,25/163)、2012年四月(14.1%,23/163)、2011年二月(10.4%,8/77)、2009年九月(7.7%,3/39)和2010年六月(6.2%,5/81)。而在临床症状上分析，只感染一种HCoV的患儿症状与共感染其他HCoV分型及其他常见的呼吸道病毒患儿症状作对比，只感染一种HCoV的患儿高热(≥38°C)(p=0.014)和不正常肺呼吸(p=0.043)症状明显比共感染其他HCoV分型及其他常见的呼吸道病毒的患儿多。另外，在HCoV4种分型的患儿症状对比，咳嗽(p=0.032)，肺炎(p=0.026)，不正常肺2 中文摘要呼吸(p=0.002)症状呈显著差异。在HCoV阳性患儿共感染病例中，出现最普遍的呼吸道病毒是流感病毒A型(21.6%,50/231)和呼吸道合胞病毒(21.6%,50/231)。三、经过3轮单克隆筛选，CLEIA结果显示抗体表达水平达到20mg/L，通过westernblotting检测到有完整的抗体分子表达并且抗体结构正确，经体外微量中和实验检测该抗体有中和活性。【结论】一、广州地区RSV的主要感染人群是0～9个月的儿童，重点在每年1月～4月；MP的主要感染人群是6～10岁的儿童，重点在每年6月～10月。预防工作要全年进行，预防因RSV和MP感染导致的住院率增高。二、广州地区总HCoV主要感染人群是7～12个月的年龄段的儿童，重点防控时间在春季及秋季。其中，OC43主要感染人群是7～12个月的年龄段的儿童，重点防控时间在春季及秋季，229E主要感染人群是4～6个月的年龄段的儿童，重点防控时间在春季，NL63主要感染人群是7～12个月的年龄段的儿童，重点防控时间在秋季，而HKU1重点防控时间在夏季。三、本研究成功构建了抗HAdv-3鼠/人嵌合中和抗体真核表达质粒，并在CHO-S细胞中稳定表达，表达的抗体也被证实有中和活性。关键词：肺炎支原体；呼吸道合胞病毒；冠状病毒；流行病学，临床症状；嵌合抗体3 广州医科大学硕士学位论文EpidemiologyofRespiratorySyncytialVirusandMycoplasmaPneumoniae,FourTypesofHumanCoronavirusandDevelopmentofHumanizedNeutralizingAntibodiesAgainstHumanAdenovirusType3Mastercandidate:ZengzhiqiAdvisor:ZhouRongAbstract【Objective】Thestudieshopetoobtaindeeperunderstandingofepidemiologyandclinicalpresentationsofrespiratorysyncytialvirusandmycoplasmapneumoniae,fourtypesofhumancoronavirus,andhopetoimproveclinicaldiagnosesforthesepathogensinfection.TolayfoundationforthedevelopmentoftherapeuticantibodiesforHAdv-3infection,wetriedtohumanizethemurineanti-HAdv-3neutralizationmonoclonalantibodywhichsecretinginhybridomacellstrain3D7.【Methods】1.Throatswabswerecollectedfromchildren(≤14yearsold)withacuterespiratorytractinfections(ARTI)inGuangzhoufromJanuary2012toJanuary2014.NucleicacidwasextractedandtestedinRSVandMPsamplesbyreal-timePCR.Clinicalpresentationsofthepatientswererecordedforfurtheranalysis.2.Wecollectedandtested11,399throatswabsfromchildrenwithARTIinGuangzhouforthefourtypesofHCoV(HCoV-229E,HCoV-NL63,HCoV-OC43andHCoV-HKU1)fromJuly2009toJune2016usingreal-timePCR.ElevenotherrespiratorypathogenswerealsotestedforHCoV-positivepatients.Clinicalpresentationsofthepatientswererecordedforfurtheranalysis．3.TotalRNAwasextractedfromthemurinemAb3D7celllines.ThefirststrandDNAwasreversedtranscript.ThenthekappaandheavychainvariableregiongenewereamplifiedbyPCRwiththeupstreamanddownstreamprimers.LchainwasconstructedbycloningthekappachainofmurinemAbintopa-L5vectorwhichcontainingthehumanlightchainconstantregionandsignalpeptide.Similarly,HchainwasconstructedbycloningtheheavychainofmurinemAbintopa-H2vectorwhichcontainingthehumanheavychainconstantregionandsignalpeptide.TheLandHchainwereclonedintopcDNA3.1vector,4 中文摘要respectively,andthentransfectedCHO-Scellstobuildastablecellline.【Results】1.Of3760patientstested,392caseswereRSVpositive(10.4%),and339caseswereMPpositive(9.0%).InRSV-infectionpediatricpatients,thepeakpositivityrateofRSV[19.6%(181/923cases)]wasfoundinpatientsattheageoflessthan9months.MonthlypeakofRSVinfectionoccurredfromFebruarytoApril2012[26.8%(136/507cases)]andfromJanuarytoApril2013[18.0%(151/839)],respectively.InMP-positivepatients,thepeakpositivityrate[20.1%(97/484cases)]wasdetectedfrompediatricpatientsattheageof6to10yearsold.MonthlypeakofMPinfectionoccurredfromJulytoOctober2012[16.3%(92/564cases)]andfromJunetoOctober2013[13.4%(124/922cases)],respectively.Morenasalobstruction[28.6%(112/392cases)]andsneezing[33.2%(130/392cases)]presentedinRSV-positivepatientsthanthoseinMP-positivepatients[15.0%(51/339cases),20.6%(70/339cases)]intheupperrespiratorytractillness,andthereweresignificantdifferences(allP<0.001).Lesscough[78.1%(306/392cases)]andexpectoration[20.4%(80/392cases)]presentedinRSV-positivepatientsthanthoseinMP-positivepatients[90.0%(305/339cases),27.1%(92/339cases)]intheupperrespiratorytractillness，andthereweresignificantdifferences(P<0.001,P=0.032).Morewheezing[33.2%(130/392cases)],shortnessofbreath[13.5%(53/392cases)],wheezerale[29.3%(115/392cases)],andphlegmrale[18.9%(74/392cases)]presentedinRSV-positivepatientsthanthoseinMP-positivepatients[11.5%(39/339cases),6.5%(22/339cases),11.5%(39/339cases),10.6%(36/339cases)]inthelowrespiratorytract,andthereweresignificantdifferences(P<0.001,P=0.002,P<0.001,P=0.002).MoreSoundcoarse[59.2%(201/399cases)]presentedinMP-positivepatientsthanthatinRSV-positivepatients[40.1%(157／392cases)]inthelowrespiratorytractillness,andtherewassignificantdifference(P<0.001).2.Ofthe11,399patientstested,489(4.3%)patientswerepositiveforHCoV,comprising346patientspositiveforOC43(3.0%),65for229E(0.6%),60forNL63(0.5%),38forHKU1(0.3%).Furthermore,somepatientswereco-infectedwithmultipleHCoV.ThetotalHCoVdetectionratewasbetween3.3%–5.5%acrossallagegroupsinvestigated.ThehighestdetectionfrequenciesoftotalHCoVandOC43wereinpediatricpatientsbetween7–12monthsofage(p<0.001).ThepeakseasonsfortotalHCoV,OC43,229E,NL63andHKU1occurredinApril2012(15.3%,25/163),April2012(14.1%,23/163),February2011(10.4%,8/77),September2009(7.7%,3/39)andJune2010(6.2%,5 广州医科大学硕士学位论文5/81),respectively.Fever(≥38°C)(p=0.014)andabnormalpulmonarybreath(p=0.043)werefoundtobesignificantclinicalsymptomswhensingleHCoVandco-infectionswithothertypesofHCoVorotherrespiratorypathogenswerecompared.Furthermore,significantdifferencesinclinicalpresentationamongHCoVtypeswerefoundtobecoughing(p=0.032),pneumonia(p=0.026)andabnormalpulmonarybreath(p=0.002).Themostcommonco-infectingrespiratoryviruseswereinfluenzaAvirus(21.6%,50/231)andrespiratorysyncytialvirus(21.6%,50/231).3.Afterthreeroundsofselection,theCLEIAresultshowedthattheantibodyexpressionlevelwas20mg/L,andWesternblottingshowedthatthechimericantibodyhadthelightandheavychainregion.Thechimericantibodyhadaneutralizingactivitybyneutralizationtestsinvitro.【Conclusion】1.RSVinfectionismostlyfoundinpatientslessthan9monthsfromJanuarytoAprileachyearandMPismostlydetectedinchildrenattheageof6to10yearsoldinJunetoOctobereachyearinGuangzhou,andmoreattentionshouldbepaid.However,controlandpreventionofinfectionshouldbeconductedalltheyearroundtodecreasethehospitalizationratecausedbyRSVandMPinfection．2.TotalHCoVandOC43infectedgrouparemostlyfoundinchildrenbetween7–12monthsofageandmoreattentionshouldbepaidinspringandautumntopreventinfection.229Einfectionismostlydetectedinpatientsbetween4–6monthsofageandmostlyfoundinspring,andNL63infectionismostlyfoundinchildrenbetween7–12monthsofageandhighfrequncyfoundinautumn,whichshouldbeconcerned.Inaddition,HKU1infectionismostlyfoundinsummer.3.Wesuccessfullyconstructedtheeukaryoticexpressionvectorofanti-HAdv-3mouse/humanchimericneutralizingantibody,andtransfectedCHO-Stobuildastablecellline.Theantibodywasconfirmedhavingneutralizingactivity.【Keywords】:respiratorysyncytialvirus;mycoplasmapneumoniae;coronavirus;epidemiology;clinicalpresentation;chimericantibody;6 前言前言1呼吸道合胞病毒1.1呼吸道合胞病毒分类呼吸道合胞病毒(RSV)属于副黏液病毒科肺炎病毒属，包括A、B两种亚型。1.2呼吸道合胞病毒结构RSV为单负链RNA病毒，在其mRNAs上有10个基因能编码11种蛋白(如图1)：SH(小疏水蛋白，其五聚体可能有离子通道作用)，F(I型膜蛋白，融合作用)，G(Ⅱ型膜蛋白，黏附作用)，M(基质蛋白)，N(核蛋白)，P(磷蛋白，RNA合成的辅助因子)，L(large蛋白，主要的RNA聚合酶)，NS1、NS2为非结构蛋白(有可能参与抗炎的蛋白)，M2(包含M2-1和M2-2，与RNA的复制及转录相关)。其中SH、F、G是跨膜蛋白，G和F蛋白是病毒膜表面主要糖蛋白，能刺激机体产生中和抗体；有研究表明，F蛋白可以作为Toll样受体4(TLR4)的配体以及通过CD14介导信号通路，产生干扰素(INF)等[1]炎症因子以完成抗病毒的过程，也有认为NS1、NS2蛋白及G蛋白在感染疾病的过程[2,3]中可能起到下调炎症因子的作用。由于F蛋白有高度保守区域，所以可以针对其抗原位点设计疫苗，并能有效预防RSVA、B两亚型的感染。图1RSV结构示意图1.3呼吸道合胞病毒感染在中国，RSV流行高峰大多在1、2月。在同一时间内，世界各地有可能同时流行不同的A、B亚型，而同一地区也可以出现A、B亚型流行变迁。RSV感染人群多集中在出生1年以内的儿童中。早产儿及低体重儿等均是RSV感7 广州医科大学硕士学位论文[4]染的重要因素，有免疫缺乏个体及65岁以上的老年人均对RSV易感。RSV主要通过飞沫、直接接触或分泌排泄物传播。RSV感染初期症状主要以上呼吸道感染症状为主：流涕，打喷嚏等。如病情继续蔓延至下呼吸道时，RSV感染会导致毛细支气管炎，肺炎等症状，严重的还会产生呼吸衰竭等重症表现而死亡。2肺炎支原体2.1肺炎支原体种类支原体是微生物中最小的生物体，广泛存在于自然界。到目前为止，人类已经发现了150多种，。支原体目下再详细分为三科：包括支原体科，螺旋原体科和无胆淄支原体科。支原体科又分为四个属：分别是血虫体属，支原体属，血巴尔通氏体属和脲原体属。其中有五种支原体能使人致病，包括MP，人型支原体，解脲支原体，生殖[5]器支原体，穿通支原体。MP是引起人类原发性典型肺炎的病原体。2.2肺炎支原体结构肺炎支原体结构没有细胞壁，其外层结构主要由细胞膜包裹。细胞膜分为三层，分别为为外蛋白质层、中间脂质层和内蛋白质层，基因组为环状双股DNA结构。所有肺炎支原体都具有P1蛋白及菌体蛋白。这两类蛋白是肺炎支原体的主要特异免疫原，是血清学诊断的主要抗原。2.3支原体肺炎发病机制肺炎支原体主要侵犯呼吸系统，引发一系列的呼吸道疾病。主要机制为：MP首先粘附在呼吸道上皮细胞表面，穿过上皮细胞纤毛屏障，以其尖端特殊结构黏附在上皮细胞的表面受体上。MP主要粘附因子为P1蛋白，P1蛋白是支原体特异性抗原中最重要的一种。P1蛋白与呼吸道粘附后，由呼吸道上皮细胞提供营养成分，提供MP维持生长需求，同时MP排出有毒代谢物到呼吸道，产生一系列呼吸道疾病。8 前言图2肺炎支原体细胞器粘附蛋白示意图3冠状病毒3.1冠状病毒分类[6]冠状病毒能依据抗原性的不同分为3大类，第一类包括人冠状病毒(HumanCoronavirus,HCoV)OC43，鼠肝炎病毒(Murinehepatitisvirus)，牛冠状病毒(Bovinecoronavirus)等，第二类包括人冠状病毒HCoV-229E，猪传染性胃肠炎病毒(Porcinetransmissiblegastroenteritisvirus)等，第三类包括禽传染性支气管炎病毒(Avianinfectiousbronchitisvirus)。3.2冠状病毒结构冠状病毒为RNA病毒，球形或多形性，核衣壳为螺旋状对称，其最明显的特征是病毒囊膜上有大量末端膨大的纤突(peplomer)。病毒颗粒囊膜有三种不同的糖蛋白，分别为S蛋白(Spikeprotein)、M蛋白(Membraneprotein)、E蛋白(Envelopeprotein)。S蛋白是冠状病毒主要抗原蛋白，其结构是囊膜伸出末端的球状结构，功能为介导病毒与宿主细胞受体的结合及促进膜融合的过程。M蛋白作为一种膜蛋白与病毒出芽及囊膜形成有关。而E蛋白体积较小，是与囊膜结合的蛋白。9 广州医科大学硕士学位论文图3：冠状病毒结构示意图3.3冠状病毒感染冠状病毒能感染人类，动物及禽类。据统计能感染人的冠状病毒有六种，分别为人冠状病毒HCoV-229E，HCoV-OC43，SARS-CoV，HCoV-NL63，HCoV-HKU1，[7]MERS-CoV。六种人冠状病毒中的HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63，HCoV-HKU1呈全球性分布及在人群中普遍存在，通常引起呼吸道感染，特别是婴幼儿，临床症状为发热，流涕，咳嗽等，严重者有毛细支气管肺炎，肺炎，喉炎等，还有少数病人有消化道等症状。2003年流行大爆发的SARS-CoV病毒，总造成8422人感染，916人死亡，死亡率处于较高水平，主要临床症状为严重的急性呼吸道感染导[8]致呼吸衰竭而死亡。最新发现的MERS-CoV在2012年及2015年存在地域性流行大爆发，临床症状是造成重症呼吸道感染导致肾功能衰竭而死亡。因为人冠状病毒导致人的临床症状是轻微的呼吸道感染，所以未引起人们的重视。但冠状病毒基因变异快，宿主范围广，容易出现导致人类致死的病毒。例如，2003年SARS-CoV及近年才发[9-12]现的MERS-CoV的爆发流行，死亡率均处于较高水平，高达50%，应给我们一个警示。4腺病毒4.1腺病毒分类腺病毒根据宿主范围不同可分为哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）及禽类腺病毒属（Aviadenovirus）。人腺病毒（Humanadenovirus,HAdV）属于腺病毒科，根据[13]免疫学等特性也分为A～G7个亚种，共有52个血清型。4.2腺病毒结构10 前言腺病毒结构呈无囊膜的球形结构，由252个壳粒组成，其中不含顶端壳粒有240个为六邻体，而12个顶点壳粒为五邻体基底。六邻体实质上是六邻体蛋白的同源三聚体，同源三聚体的六邻体分子有五面体的基底和一个三角形的塔尖，基底包含P1，[14]P2两个区域，塔尖包含4个环状结构组成即loop1，loop2，loop3，loop4。六邻体的表位是诊断不同血清型的主要标准，也被证明是产出特异性中和抗体的重要靶点[15-17]。而五邻体基底上连接着1跟或2跟长为9～77.5mm的纤维突起，纤维顶端形成头节区。纤突含有负责体外血细胞凝集的种属特异性抗原决定位点(如图4)。图4腺病毒结构示意图4.3腺病毒感染腺病毒的传播途径主要通过人，水，器械等传播。在常温下，腺病毒能在被污染物种存活可长至3周。腺病毒在儿童更容易发生感染并且大规模流行，研究表明大多[18]数婴幼儿在出生后至少感染过1种腺病毒。腺病毒也能感染免疫力低下的宿主，例如：免疫遗传缺陷的病人，艾滋病人，造血干细胞移植者常能引发高发病率与死亡率[19]。其中HAdv-3症状比腺病毒其他亚型更为严重，在全年整年都均能导致一系列的[20]呼吸道及肠道等临床症状。腺病毒是没包膜病毒，在低的pH环境下也可稳定存活，有强的耐化学和物理试剂作用，和腺病毒可抵抗胃肠分泌物及胆汁的分解，所以它能在胃肠内大量复制。因为腺病毒能在人的咽，肠道，呼吸道内繁殖，所以它的感染能导致许多临床症状，例如：呼吸道感染，胃肠炎，肝炎等。5治疗性单抗药物11 广州医科大学硕士学位论文5.1治疗性单抗药物的诞生mAb治疗性药物在1986年开始，Ortho等研发了抗CD3的鼠源性mAbOrthoclone[21]OKT3，成为世界上第一个获FDA认证并上市销售的治疗性抗体，临床上用于治疗肾移植后的移植排斥反应。到了2011年，有将近30种mAb治疗性药物获得美国FDA的批准，有40种mAb治疗性药物进入Ⅲ期临床试验，并且有上百种进入临床试验的不同阶段。mAb治疗性药物主要治疗癌症，病毒感染，自身免疫性疾病等。治疗性抗体对疾病治疗取得了一定的疗效，并得到社会的认可。例如：2004年上市的Cetuximab[22,23]嵌合抗体药物能有效治疗对化学药物耐药的直肠癌。Tanox公司研发的Ibalizumab(TNX-355)人源化抗CD4mAb药物，在Ⅱ期临床试验中，结果证实有良[24]好的安全性及抗病毒作用。在先前的研究中，本课题组已构建3、7型嵌合腺病毒rAdMHE3，并以此作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术分别筛选出能分泌针对HAdV-3的中和抗体的单克隆杂交瘤细胞株，为建立腺病毒直接免疫荧光检测及治疗性抗体研发奠定了基础。5.2抗体人源化改造技术进展按照现在的技术不需要制备鼠源性mAb就能获得全人源抗体，例如：噬菌体抗体库筛选技术。但目前全人源抗体的制备技术还没有完全成熟，存在着分泌量低，成本高等缺点。而制备分泌鼠源性mAb的杂交瘤细胞技术就十分成熟，不仅能获得高产量的特异性抗体，而且成本低。最早上市用于临床的抗体类药物是鼠源性mAb，例如：OrthocloneOKT3。但是当给患者多次用药时，患者体内会产出人抗鼠抗体(humananti-mouseantibody,HAMA)。此时，患者的症状没有减弱，反而有可能导致严重的免疫反应，所以有必要对鼠源性mAb进行人源化改造。常见的人源化改造是采用基因重组技术来降低鼠源成分，保持抗体对抗原的亲和[25]力，从而达到降低抗体免疫原性的目的。常见的人源化改造策略包括：（1）嵌和抗体：指把鼠源性mAb可变区基因与人源性抗体恒定区基因连接的改造抗体。主要过程是：把分泌鼠源性mAb杂交瘤细胞裂解提取全RNA并逆转录cDNA，以此cDNA为模板分别扩增抗体轻链可变区基因及重链可变区基因，把此可变区基因与人源性抗体恒定区基因拼接形成鼠/人嵌和基因，把此鼠/人嵌合基因转染到表达系统中表达，即能分泌鼠/人嵌合抗体。此方法的好处是能相对保持可变区及恒定区的蛋白结构完整性，保持鼠源亲本抗体的亲和性，减少HAMA反应，同时正常发挥人源[26,27]性恒定区的功能，有效发挥ADCC及CDC作用。目前获FDA认证的嵌合抗体12 前言[28]包括：Abciximab，Inflixmab，Cetuximab等,临床上已证明有一定的疗效。虽然嵌合抗体对于HAMA反应有所下降，但仍然存在，还没有达到理想的效果。（2）抗体互补决定区(CDR)的移植：CDR移植指把鼠源性抗体的CDR区替换人源性抗体对应的CDR区。CDR移植分为3种：CDR全移植，CDR部分移植，特定决定区(SDR)移植。CDR全移植是指把鼠源性抗体的六个CDR序列完全替换到人源性抗体相对应的六个CDR序列。部分CDR移植是指通过对鼠源性mAbCDR区进行研究，把影响抗原抗体亲和性较大的CDR序列移植到人源性抗体框架内对应的位置。有研究表明：轻链的CDR1，CDR2，重链的CDR3是影响抗原抗体亲和力最[29]为重要的区域。SDR移植：是指将鼠源性抗体中影响抗原抗体亲和力的CDR区中的SDR移植到人源性抗体框架中对应位置。这些方法的目的是尽可能减少鼠源性进而减少HAMA反应。（3）表面塑性：该方法主要依据是鼠源性mAb表面残基能引发抗体免疫原性，所以它原理是将鼠源性mAb可变区框架上的表面氨基酸进行人源化改造，通过将人源性抗体可变区和鼠源性mAb可变区进行结构上的比较，寻找相匹配的人源性抗体的序列，将鼠源性mAb可变区序列上有可能产生免疫原性的氨基酸改为人源性抗体氨基酸，达到降低免疫原性的效果。（4）抗原表位定向选择：此方法利用核糖体展示技术或噬菌体筛选技术筛选出最佳人源化抗体的方法。原理是构建人源性抗体的抗体库，利用体外抗原筛选出亲和力高，表达量高的完全人源化的mAb。但是此方法缺点是，对噬菌体库的库容量要求7较高，库容量至少达到10，所以这方法的成功率较低。相比几种方法，本实验室之前已筛选出分泌抗HAdv-3具有中和活性鼠源性mAb[30]的杂交瘤细胞株3D7，加上鼠/人嵌合抗体对抗原的亲和力较高，方法较为成熟，所以本课题应用基因重组技术构建抗HAdv-3mAb的鼠/人嵌合抗体并在哺乳细胞中成功表达，构建稳定细胞系。13 广州医科大学硕士学位论文第一部分呼吸道合胞病毒与肺炎支原体流行病学分析[31,32]呼吸道感染一直是困扰人类最常见、发生率最高的疾病，是引起老人和儿童死亡最多的病因，也是新发和突发传染病的最主要病原因素。每年急性呼吸道感染在[33,34]发展中国家导致大量的儿童死亡，死亡的主要病因均为肺炎。其中呼吸道合胞病[35-38]毒(RSV)与肺炎支原体(MP)是最常见的致儿童肺炎的病原体。RSV是儿童下[39,40][41]呼吸道感染最重要的病毒病原体，近年来MP感染的发病率呈上升趋势。为了解广州地区儿童RSV与MP感染的流行病学状况，本研究对2012年1月～2014年1月在广州医科大学附属第一医院和中山大学孙逸仙纪念医院采集的急性呼吸道疾病患咽拭子标本进行检测，为广州地区RSV与MP的监控和防治提供参考。材料与方法1实验材料1.1标本采集2012年1月～2014年1月广州医科大学附属第一医院和中山大学孙逸仙纪念医院急性呼吸道疾病患儿(≤14岁)咽拭子标本。其病例数分别为3256例与504例。[42]病例纳入标准：患儿至少有咳嗽、咽部不适、鼻塞、流涕、打喷嚏、呼吸困难或胸部X线摄影确诊的肺炎2个表现。采集的咽拭子置于病毒运输液中，并于冰上运输至呼吸疾病国家重点实验室，立即提取核酸检测或置-70℃冰箱保存备用。年龄分组：0～3个月、4～6个月、7～9个月、10～12个月、1～2岁、3～5岁、6～10岁、11～14岁组。本研究获得医院医学伦理委员会批准，人选患儿家属均签署知情同意书。1.2耗材及生化试剂试剂耗材名称生产厂家RSV、MP核酸检测试剂盒广州呼研所医药科技有限公司鼻咽拭子深圳市麦瑞科林科技有限公司病毒运送液呼吸疾病国家重点实验室病毒室配制庆大霉素，青链霉素呼吸疾病国家重点实验室病毒室配制样枪(10μL/100μL/200μL/1000μL)Gilson/Thermo14 第一部分呼吸道合胞病毒与肺炎支原体流行病学分析枪头(10μL/100μL/200μL/1000μL)AxygenEP管(0.6ml、1.5ml)Axygen1.3仪器设备及生产厂家仪器设备名称生产厂家普通离心机中国上海安亭科学仪器厂普通PCR仪Biometra超纯水系统Barnstead全自动荧光定量PCR仪美国应用生物系统公司电泳槽中国百晶生物技术有限公司生物安全柜中国海泰克生物技术公司凝胶成像系统Bio-rad低速离心机中国湖南湘仪离心机公司高速冷冻离心机Sigma振荡器中国上海苏坤实业有限公司灭菌锅中国新华生物公司制冰机中国杭州马尼托克公司2方法2.1核酸提取本实验采用异硫氰酸胍法1)480μL裂解液(异硫氰酸胍)+120μL样本(充分混匀，放置5min)，加入600μL异丙醇，13000rpm10min，离心，弃上清；2)往沉淀加入500μL75%乙醇，13000rpm，5min离心，弃上清，晾干；3)加入120μL的DEPC水，震荡，混匀，准备上机。2.2呼吸道合胞病毒(RSV)与肺炎支原体(MP)的检测RSV与MP检测采用荧光定量PCR核酸检测。RSV荧光定量PCR核酸检测试剂盒与MP荧光定量PCR核酸检测试剂盒购于广州呼吸研究所医药科技有限公司，操作流程与试剂盒说明书一致。检测仪器为ABI7500荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。1）荧光定量PCR反应体系15 广州医科大学硕士学位论文反应试剂20ulTap酶0.2μl逆转录酶0.5μl标本模板5μl反应总体系25μl。2）反应仪器程序设定：第一步48℃5min；第二步94℃2min；第三步94℃10s，55℃35s，40个循环(如下图)。2.3统计学分析处理应用SPSS软件进行统计分析(version19.0;SPSSInc.,Chicago,IL)，RSV与MP2阳性症状比较采用χ检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果1.急性呼吸道疾病患儿总体特征2012年1月～2014年1月共收集3760例急性呼吸道疾病患咽拭子标本，均来自住院病例，每月至少121例。男女比率为1.7(2363:1374)；中位年龄为2.0岁。年龄分组：0～3个月223例(5.9%)，4～6个月335例(8.9%)，7～9个月365例(9.7%)，10~12个月121例(3.2%)，1～2岁1151例(30.6%)，3～5岁953例(25.3%)，6～10岁484例(12.9%)，11～14岁124例(3.3%)。16 第一部分呼吸道合胞病毒与肺炎支原体流行病学分析2.RSV与MP阳性患者分布在3760例急性呼吸道疾病患儿中，RSV阳性392例，阳性率为10.4%，MP阳性339例，阳性率为9.0%。其中，RSV阳性患儿的中位年龄为1.0岁，男女比率为2.1(266:124)。MP阳性患儿中位年龄为4岁，男女比率为1.2(182:157)。3.RSV与1MP阳性患者的年龄分布RSV在0～9个月患儿阳性率最高19.6%(181/923例)。随后逐渐降低，其中1～2岁患儿阳性率较高，为12.3%(142/1151例)，2岁后患儿阳性率处于较低水平。MP阳性率随年龄的增加有上升的趋势。MP患儿在3岁后的阳性率逐渐升高，6～10岁患儿阳性率最高，达20.1%(97/484例)，其次是11～14岁患儿，阳性率为15.3%(19/124例)，见图1。25%RSVMP20%15%(%)阳性率10%5%0%年龄组图1呼吸道合胞病毒与肺炎支原体不同年龄阳性率Figure1ThedistributionsofrespiratorysyncytialvirusandMycoplasmaPneumoniaeamongdifferentpediatricagegroups4.RSV与MP阳性患者的季节分布RSV在2012年2月～4月阳性率最高，达26.8%(136/507例)，4月后逐渐下降，6月降至最低[2.1%(3/140例)]。2013年RSV流行高峰在1月～4月，阳性率为18.0%(151／839例)，5月开始下降，保持低水平的3个月后，8月～9月出现小高峰，阳性率分别为12.5%(26/208例)和10.6%(21/198例)，9月阳性率处于较低水平，12月降至最低[0.5%17 广州医科大学硕士学位论文(1/200例)]。2012年MP流行高峰在7月～10月，阳性率为16.3%(92/564例)，在2012年MP阳性率在1月～4月处于较低水平，5月开始升高，持续到10月，8月阳性率最高，阳性率为19.7%(28/142例)。10月后阳性率逐渐下降。2013年MP流行高峰在6月～10月，阳性率为13.4%(124/922例)，MP阳性率在1月～4月较低，5月开始升高，持续到10月，8月阳性率最高，阳性率为15.4%(32/208例)。10月后阳性率逐渐下降，12月降至最低[2%(4/200例)]，见图2。35%RSVMP30%25%(%)20%15%阳性率10%5%0%时间图2广州地区2012年1月～2014年1月不同月份呼吸道合胞病毒与肺炎支原体阳性率Figure2MonthlydistributionofrespiratorysyncytialvirusandMycoplasmapneumoniaeinGuangzhoufromJanuary2012toJanuary20145RSV与MP临床症状分析RSV上呼吸道症状排名前3依次为咳嗽(78.1%)、流涕(33.2%)、鼻塞(28.6%)，下呼吸道症状排名前3依次为双肺呼吸音粗(40．1%)、湿啰音(40.0%)、气喘(33.2%)，见表1。MP上呼吸道症状排名前3依次为咳嗽(90.0%)、咳痰(27.1%)、流涕(20.6%)，下呼吸道症排名前3依次为双肺呼吸音粗(59.2%)、湿啰音(44.5%)、肺炎(21.8%)。RSV感染患儿鼻塞、流涕发生率显著高于MP阳性患儿，2组比较差异均有统计学意义(P均<0.001)；RSV感染患儿咳嗽、咳痰发生率显著低于MP阳性患儿，2组比较差异均有统计学意义。在下呼吸道症状中，RSV阳性患儿气喘、气促、喘鸣音、痰鸣音发生率显著高于MP阳性患儿，2组比较差异均有统计学意义。MP阳性患儿双肺呼吸音粗较RSV阳性患儿更为多见，2组比较差异有统计学意义，见表1。18 第一部分呼吸道合胞病毒与肺炎支原体流行病学分析表1呼吸道肺炎支原体、呼吸道合胞病毒阳性表现对比[例(%)]Table1Clinicalpresentationsofrespiratorysyncytialvirus-positiveandMycoplasmapneumoniae-positivepatients[n(%)]2临床症状RSV阳性(n=392)MP阳性(n=339)χ值P值上呼吸道表现鼻塞112(28.6)51(15.0)19.199<0.001流涕130(33.2)70(20.6)14.325<0.001打喷嚏10(2.6)6(1.8)0.5180.472咽痛不适2(0.5)9(2.7)5.6410.176声嘶2(0.5)1(0.3)0.0160.650咳嗽306(78.1)305(90.0)18.791<0.001咳痰80(20.4)92(27.1)4.5770.032下呼吸道表现肺炎96(24.5)74(21.8)0.7210.396胸闷1(0.3)1(0.3)--胸痛1(0.3)2(0.6)--气喘130(33.2)39(11.5)47.979<0.001气促53(13.5)22(6.5)9.7600.001干啰音18(4.6)14(4.1)0.0930.761湿啰音157(40.0)151(44.5)1.5040.22痰鸣音74(18.9)36(10.6)9.6980.002喘鸣音115(29.3)39(11.5)34.763<0.001哮鸣音13(3.3)5(1.4)2.5670.109水泡音33(8.4)30(8.8)0.0430.836喉鸣音5(1.3)2(0.6)--呼吸音粗157(40.1)201(59.2)26.932<0.001注：-表示病例例数过少，未做比较-:thenumberofcaseswastoosmall,andthecomparisonisnotmade19 广州医科大学硕士学位论文讨论本研究对2012年1月～2014年1月期间广州地区急性呼吸道疾病患儿进行了RSV与MP感染监测，发现RSV阳性率为10.4%，MP阳性率为9.0%，提示RSV及MP感染为[43]广州地区儿童呼吸道感染的常见病原体。本研究发现RSV阳性率为10.4%，陈翊等应用实时荧光定量PCR法检测2009年～2010年广州地区急性呼吸道感染患儿RSV2009年及2010年的阳性率为分别为7.25%和9.73%，本结果与之相符。本研究发现RSV在0～9个月患儿阳性率最高19.6%(181/923例)，为RSV主要感染人群，基本符合张定[44]梅等广东省2009年～2012年RSV的流行病学特征中2岁前阳性率最高的结果。本结果时间分布显示冬春季RSV阳性率较高，为主要流行季节，2013年阳性率从1月份增高，5月份开始下降，与广州地区气候有一定关系，广州属亚热带气候，2月～3月份，降雨多，温度低，湿度大，易发生呼吸道感染。报道显示南韩地区2011年～2012年及[45]2012年～2013年儿童RSV感染高峰月份都是10月～12月，与广州RSV感染高峰期不[46]同。且与墨西哥地区2004年～2008年儿童RSV感染流行高峰8月～下年3月存在差异。提示儿童RSV感染状况存在地域差异，可能与各地气候不同有关，与影响RSV的繁殖感染或影响儿童对RSV的易感性有关。本研究表明，上呼吸道表现，如咳嗽(78.1%)、流涕(33.2%)、鼻塞(28.6%)最为常见；也导致一系列下呼吸道表现，如双肺呼吸音[47]粗(40.1%)、湿啰音(40.0%)、气喘(33.2%)最为常见。deIta等研究表明，4～12岁为MP感染的易感年龄，而本研究显示广州地区6～10岁年龄组呼吸道感染患儿阳性率达20.1%，提示该年龄组MP感染发病率明显高于其他年龄组，所以应提高对6～10[48]岁儿童MP感染的认识。由于地区气候、环境差异，MP发病高峰有明显差异。He等[49]报道在重庆MP感染发病高峰期在2月～4月，而5月～7月发病率较低；Chang等对中国台湾地区MP感染流行病调查表明，7月～10月为MP感染的高发季节。本结果表明，2012年及2013年广州地区呼吸道感染患儿MP阳性率分别在6月～10月及5月～10月最高，提示5月～10月是MP感染的高发时间，这可能与广州地区夏秋季温暖、干燥少雨有关。从RSV与MP的阳性率季节分布看出，有可能提示RSV与MP阳性率分布呈相反[48]走向。He等发现MP时上呼吸道表现咳嗽(19.8%)及下呼吸道表现喘鸣(20.2%)、[50]湿啰音(20.9%)、干啰音(19.7%)等常有发生。Oskooee等报道MP引起常见的呼吸道表现有咳嗽(97.1%)、鼻炎(57.8%)、呼吸急促(45.1%)。本研究发现，MP感染可引起上呼吸道表现，也能导致一系列下呼吸道表现。通过RSV与MP上下呼吸道临床20 第一部分呼吸道合胞病毒与肺炎支原体流行病学分析表现对比，在上呼吸道表现中，鼻塞、流涕在RSV阳性患儿中更为多见，咳嗽、咳痰在MP阳性患儿中更为多见。在下呼吸道表现中，气喘、气促、喘鸣音、痰鸣音在RSV阳性患儿中更为多见。双肺呼吸音粗在MP阳性患儿中更为多见。但本研究可能仍存在不足之处，需进一步加大样本量，从而获得更加准确完善的数据。结论广州地区RSV的主要感染人群是0～9个月的儿童，重点在每年1月～4月；MP的主要感染人群是6～10岁的儿童，重点在每年6月～10月。预防工作要全年进行，预防因RSV和MP感染导致的住院率增高。21 广州医科大学硕士学位论文第二部分四型人冠状病毒流行病学分析人冠状病毒(HCoV)-229E,-NL63,-OC43and-HKU1与一系列的上呼吸道疾病[51-54]有关，偶然还会引发下呼吸道疾病，例如肺炎和支气管炎。特别的是，HCoV[55,56][57-59]感染的患儿也能出现严重的呼吸道疾病。HCoV在全球范围内传播，但是[60-65]四种型别的HCoV的阳性率在不同季节及地理位置上都有差异。而世界上的[66-69]HCoV流行病学分析缺乏长期调查研究，这势必阻碍了流行病学与临床表现的比较。为了解决这个问题，我们收集和分析了广州7年来11,399例四型HCoV患儿的大规模及长期的流行病学数据，从而为HCoV的流行病学和临床意义提供了新的见解。材料和方法1实验材料1.1标本收集广州地区2009年7月1日～2016年6月30日期间广州医科大学附属第一医院及孙逸仙纪念医院急性呼吸道感染(ARTI)患儿(≤14岁)咽拭子标本，共11399例。标本置于病毒运输液中，2～8℃冰箱保存，于48h内送往实验室，立即提取核酸，提取的核酸置-70℃冰箱保存备用。临床症状分别划分为三大类：上呼吸道感染症状，流感样症状，下呼吸道感染症状。上呼吸道感染症状包括咳嗽，咳痰，流涕，鼻塞，打喷嚏，咽部不适。流感样症状包括：高热（≥38°C），寒栗，头晕，头痛，肌痛，乏力。下呼吸道感染症状包括：支气管肺炎，肺炎，气喘，气促，胸闷，胸痛，不正常肺呼吸。支气管肺炎，肺炎症状结果由胸片检查诊断。1.2耗材及生化试剂试剂耗材名称生产厂家核酸检测试剂盒广州呼研所医药科技有限公司鼻咽拭子深圳市麦瑞科林科技有限公司病毒运送液呼吸疾病国家重点实验室病毒室配制庆大霉素，青链霉素呼吸疾病国家重点实验室病毒室配制加样枪Gilson/Thermo22 第二部分四型人冠状病毒流行病学分析(10μL/100μL/200μL/1000μL)枪头Axygen(10μL/100μL/200μL/1000μL)EP管(0.6ml、1.5ml)Axygen1.3仪器设备及生产厂家仪器设备名称生产厂家普通离心机中国上海安亭科学仪器厂普通PCR仪Biometra超纯水系统Barnstead全自动荧光定量PCR仪美国应用生物系统公司电泳槽中国百晶生物技术有限公司生物安全柜中国海泰克生物技术公司凝胶成像系统Bio-rad低速离心机中国湖南湘仪离心机公司高速冷冻离心机Sigma振荡器中国上海苏坤实业有限公司灭菌锅中国新华生物公司制冰机中国杭州马尼托克公司2实验方法2.1核酸提取本实验采用异硫氰酸胍法1)480μL裂解液（异硫氰酸胍）+120μL样本（充分混匀，放置5min），加入600μL异丙醇，13000rpm，10min，离心，弃上清；2)往沉淀加入500μL75%乙醇，13000rpm，5min，离心，弃上清，晾干；3)加入120μL的DEPC水，震荡，混匀，准备上机。2.2四种冠状病毒亚型核酸检测本实验采用荧光定量PCR检测。主要检测样本中包括HCoV-229E，HCoV-NL63，23 广州医科大学硕士学位论文HCoV-OC43和HCoV-HKU1的核酸情况，以上各亚型引物及探针由呼研所科技有限公司提供。1）荧光定量PCR反应体系反应试剂20ulTap酶0.2μl逆转录酶0.5μl标本模板5μl反应总体系25μl。2）反应仪器程序设定：第一步48℃5min，94℃2min；第二步94℃2min；第三步94℃10s，55℃35s，40个循环(如下图)。2.311种常见呼吸道病毒共感染的检测本实验对HCoV阳性标本进行其他11种常见呼吸道病毒的检测，包括：流感A病毒(FluA)，流感B病毒(FluB)，腺病毒(ADV)，人鼻病毒(HRV)，人偏肺病毒(HMPV)，肠道病毒(EV)，肺炎支原体(MP)，肺炎衣原体(CP)，呼吸道合胞病毒(RSV)，人博卡病毒(HBoV)，4个亚型的副流感病毒(HPIV)。检测方法也是采用荧光定量PCR，引物及探针由呼研所科技有限公司提供。2.4统计学分析[42]所有数据由SPSS统计软件(version19.0;SPSSInc.,Chicago,IL)分析。在数据比24 第二部分四型人冠状病毒流行病学分析较中，使用了卡方检验与费尔切精确检验。所有的比较中均认为p<0.05视为有显著的统计学意义。结果1HCoV在儿童患者中的流行病学分析本研究收集了11399例广州地区2009年7月1日～2016年6月30日期间广州医科大学第一附属医院及孙逸仙纪念医院急性呼吸道感染(ARTI)患儿咽拭子标本。患儿的年龄中位数是1.75岁，男女比例为1.82(7361:4038)。在11399个患儿中，总HCoV阳性率为4.3%(489/11399)，其中患儿年龄中位数为1.25岁，男女比例为1.67:1(306:183)。OC43阳性率为3.0%(346/11399)，其患儿年龄中位数为1.29岁，男女比例为1.72:1(219:127)。NL63阳性率为0.5%(60/11399)，其患儿年龄中位数为1.17，男女比例为1.73:1(38:22)。HKU1阳性率为0.3%(38/11399)，其患儿年龄中位数为1.33，男女比例为2.17:1(26:12)。229E阳性率为0.6%(65/11399)，其患儿年龄中位数为1.33，男女比例为1.32:1(37:28)。2HCoV共感染分析取489例HCoV阳性患儿标本继续对另外10种常见呼吸道病毒进行荧光定量PCR检测，其中共感染率为47.2%(231/489)。229E，OC43，NL63，HKU1共感染率分别为58.5%(38/65)，46.6%(161/346)，55%(33/60)，50%(19/38)(p=0.258,见表1)。在231例共感染案例当中，有176例(76.2%)共感染两种病毒，有48例(20.8%)共感染三种病毒，有6例共感染4种病毒，有1例共感染6种病毒。在所有HCoV阳性患儿中，共感染最多的病毒是FluA(21.6%,50/231)和RSV(21.6%,50/231)。只有1.7%(4/231)的患儿共感染CP。在OC43阳性患儿中，共感染最多的病毒是FluA(23.6%,38/161)。在229E患儿中，共感染最多的病毒是其他亚型的HCoV(39.5%,15/38)。在NL63患儿中，共感染最多的病毒是RSV(30.3%,10/33)。虽然HKU-1阳性患儿较少，但是也有42.1%(8/19)HKU1阳性患儿共感染了MP。25 广州医科大学硕士学位论文表1：人四种HCoV亚型阳性患儿的共感染情况Co-DetectionHCoV(n=231)229E(n=38)OC43(n=161)NL63(n=33)HKU1(n=19)FluA50(21.6)7(18.4)38(23.6)4(12.1)4(21.1)RSV50(21.6)10(26.3)29(18.0)10(30.3)3(15.8)MP39(16.9)3(7.9)27(16.8)3(9.1)8(42.1)HPIV33(14.3)5(13.2)27(16.7)2(6.1)1(5.3)ADV22(9.5)3(7.9)14(8.7)5(15.2)2(10.5)EV20(8.6)4(10.5)10(6.2)6(18.2)1(5.3)HCoV*18(7.8)15(39.5)16(9.9)4(12.1)2(10.5)HBoV15(6.5)0(0)9(5.6)3(9.1)3(15.8)HMPV15(6.4)3(7.9)14(8.7)1(3.0)0(0)HRV13(5.6)2(5.3)10(6.2)1(3.0)0(0)FluB10(4.3)0(0)9(5.6)0(0)1(5.3)CP4(1.7)0(0)3(1.9)1(3.0)0(0)a．()里数据以%展示。由于一些患儿感染不止一种病毒，百分比总和超过100%。b．*存在四种人HCoV亚型种间共感染情况。a.DataarepresentedasNo.(%)ofeachgroup.Percentagessumtoover100%becausesomepatientshadmorethanonediagnosis.b.*DetectionwithoneormorethanoneothertypesofHCoVFluA,influenzaAvirus;FluB,influenzaBvirus;ADV,adenovirus;HRV,humanrhinovirus;HMPV,humanmetapneumovirus;EV,enterovirus;MP,Mycoplasmapneumoniae;CP,chlamydiapneumoniae;RSV,respiratorysyncytialvirus;HBoV,humanbocavirus;HPIV,humanparainfluenzavirus,HCoV,humancoronavirus.3HCoV阳性率年龄分布情况四种人HCoV亚型在0～14岁患儿标本中被分离(见图1)。四种人HCoV亚型阳性有不同的年龄。总HCoV和OC43阳性率在不同的年龄组中有显著性意义，总HCoV和OC43阳性率在7～12个月年龄组最高，分别是5.9%(71/1203,p<0.001)和4.1%(49/1203,p<0.001)。229E和NL63最高阳性率分别发生在4～6个月(1.0%,11/1084,p=0.429)和7～12个月(0.9%,11/1203,p=0.437)，但是这差别并没有显著性差异。至于HKU1，因为样本太少以至于不能评估该病毒的阳性率分布。26 第二部分四型人冠状病毒流行病学分析765229E4OC433NL632HKU1Positiverate(%)HCoV100–3m4–6m7–12m1–2y3–5y6–10y11–14yAgegroups图1.HCoV阳性率年龄分布状况Fig1.DetectionfrequenciesofHCoVstratifiedbyage4HCoV阳性率季节分布状况总的来说，HCoV在广州地区7年的调查中有明显的季节分布。总HCoV最高阳性率发生在2009年10月(10.3%,4/39)，2011年2月(11.7%,9/77)，2011年4月(13.2%,14/106)，2012年4月(15.3%,25/163)，2012年8月(13.4%,19/142)，2013年7月(11.7%,23/196)，2014年1月(11.0%,17/154)，2015年9月(9.7%,7/72)，这些月份对应春季及秋季。对于NL63，最高阳性率发生在2009年8月(4.8%,2/42)和9月(7.7%,3/39)，2010年8月(3.9%,5/128)，2011年4月(2.8%,3/106)，2012年8月(3.5%,5/142)，2015年9月(4.2%,3/72)。除了在2011年2月(10.4%,8/77)阳性率最高，229E感染病例在这7年间均有零星发生。对于OC43，7年间每个月都能检出，最高阳性率发生在2009年10月(7.7%,3/39)，2011年4月(8.5%,9/106)，2011年11月(7.1%,9/127)，2012年4月(14.1%,23/163)，2012年8月(9.9%,14/142)，2013年7月(11.2%,22/196)，2013年9月(9.0%,18/199)，2014年1月(9.1%,14/154)。HCoV季节分布情况大致由NL63，229E和OC43最高阳性率组成，均发生春季与秋季。相反，HKU1最高阳性率出现在2010年6月(6.2%,5/81)及2013年6月(5.1%,8/156)，在其他月份几乎没有检出。27 广州医科大学硕士学位论文图2.2009年7月至2016年6月人4种HCoV亚型季节分布情况。Fig2.SeasonaldistributionofthefourHCoVtypesfromJuly2009toJune2016.28 第二部分四型人冠状病毒流行病学分析5HCoV临床特征分析HCoV临床特征分析主要比较不同HCoV亚型间的临床症状及比较HCoV单重感染和HCoV与其他呼吸道病毒共感染的临床症状(见表2)。在258例HCoV单重感染和231例HCoV与其他呼吸道病毒共感染的比较中，不正常肺呼吸在HCoV单重感染患儿中的比例(63.6%,164/258)明显比HCoV与其他呼吸道病毒共感染患儿(54.5%,126/231,p=0.043)高。相反，高热(≥38°C)症状在HCoV与其他呼吸道病毒共感染患儿中的比例(66.2%,153/231)明显比HCoV单重感染患儿多(55.4%,143/258,p=0.014)。HCoV临床特征在不同HCoV亚型中也有显著差异。其中具有显著差异的症状包括：咳嗽(p=0.032)，肺炎(p=0.026)，不正常肺呼吸(p=0.002)。除了上述的症状外，没有其他有显著差异的症状。29 广州医科大学硕士学位论文图2.HCoV临床症状CharacteristicsCo-infectedwithHCoV4typesdistributionsin489HCoV-positivepatients*§※SingleHCoV(n=258)Co-pathogens(n=231)pvalue229E(n=65)OC43(n=346)NL63(n=60)HKU1(n=38)pvalueCoughing214(82.9)198(85.7)0.40152(80.0)298(86.1)43(71.7)33(86.9)0.032Expectoration87(33.7)81(35.0)0.75520(30.8)119(34.4)15(25.0)18(47.4)0.137Rhinorrhoea87(33.7)87(37.7)0.36324(36.9)123(35.6)21(35.0)13(34.2)0.993Rhinobyon79(30.6)69(29.9)0.85722(33.9)106(30.6)15(25.0)12(31.6)0.747Sneezing10(3.9)10(4.3)0.8014(6.2)16(4.6)2(3.4)0(0)-†Pharynxdiscomfort17(6.6)15(6.5)0.9668(12.3)22(6.4)4(6.8)3(7.9)0.381Trachyphonia9(3.5)0(0)-1(1.5)3(0.9)5(8.3)0(0)-oFever(≥38C)143(55.4)153(66.2)0.01438(58.5)213(61.6)32(53.3)23(60.5)0.662Chills8(3.1)11(4.8)0.3433(4.6)16(4.6)1(1.7)1(2.6)0.859Dizziness0(0)1(0.5)-0(0)1(0.3)0(0)0(0)-Headache2(0.8)1(0.5)0.9230(0)3(0.9)0(0)0(0)-Myalgia0(0)0(0)-0(0)0(0)0(0)0(0)-Debilitation1(0.4)2(0.9)0.9230(0)3(0.9)0(0)0(0)-Bronchopneumonia47(18.2)52(22.5)0.23812(18.5)79(22.8)8(13.3)6(15.8)0.295Pneumonia26(10.1)32(13.9)0.19713(20.0)34(9.8)12(20.0)6(15.8)0.026Asthma70(27.1)64(27.7)0.88716(24.6)99(28.6)13(21.7)9(23.7)0.632Shortnessofbreath35(13.6)28(12.1)0.6347(10.8)42(12.1)9(15.0)6(15.8)0.776Chesttightness1(0.4)0(0)-0(0)1(0.3)0(0)0(0)-Chestpain1(0.4)1(0.4)0.9260(0)2(0.5)0(0)0(0)-Abnormalpulmonary164(63.6)126(54.5)0.04330(46.2)193(55.8)18(30.0)19(50.0)0.002‡breath30 第二部分四型人冠状病毒流行病学分析a．()里数据以%展示。由于一些患儿感染不止一种病毒，百分比总和超过100%。b.症状1～7为上呼吸道症状，8～13为流感样症状和14～20为下呼吸道症状。§c.使用卡方检验比较HCoV单重感染及HCoV与其他呼吸道病毒多重感染的每个临床症状。※d.使用卡方检验比较HCoV不同分型的临床症状。†e.包括咽干，咽痛。‡f.包括痰鸣音，哮鸣音，水泡音，湿啰音，喉鸣音。g.“-”因样本太少不能做检测。a.DataarepresentedasNo.(%)ofeachgroup.Percentagessumtoover100%becausesomepatientshadmorethanonediagnosis.b.labelrows1-7asURTI,rows8-13asinfluenza-likesymptoms&rows14-20asLRTI§2c.Two-tailedχtest,testingthedistributionofeachillnessordiagnosisbetweenpatientssolelyinfectedwithHCoVandthoseco-infected.※2d.Two-tailedχtest,testingthedistributionofeachillnessordiagnosisbetweenthefourHCoVtypes.†e.Includingpharyngealdrynessandpharyngalgia.‡f.Includingphlegmrale,wheezerale,bubblingrale,moistrale,laryngealstridor.g.“-”meansnotdonebecauseoftoofewsample.讨论本研究分析了11399例广州地区2009年7月1日～2016年6月30日期间广州医科大学附属第一医院及孙逸仙纪念医院急性呼吸道感染(ARTI)患儿咽拭子标本。本研究获得了对于HCoV流行病学及临床症状分析有意义的结果。在11399个患儿当中，有489(4.3%)个患儿是总HCoV阳性。HCoV出现最多的亚型是OC43(3.0%)，接着是229E(0.6%)，NL63(0.5%)和HKU1(0.3%)。这些OC43，229E，NL63，HKU1患儿的阳性率[64,65,70]与世界上已发表的文章类似。与HCoV共感染最多的呼吸道病毒是FluA和RSV。最近的研究也曾发表过与HCoV共感染最多的呼吸道病毒有RSV，FluA，鼻病毒，并[54,55,71-73]提示这些共感染的病毒有可能导致HCoV阳性患儿的临床症状发生改变。近来几个国家研究包括美国，沙特阿拉伯，斯洛文尼亚也证实了HCoV阳性率最[68,69,71]高也发生在7～12个月年龄组中，并与本研究结果符合。由于生活环境存在高31 广州医科大学硕士学位论文[74-76]载量的病毒和小孩自身不完善的免疫系统，小孩会更容易遭受呼吸道病毒的感染。众所周知的是，HCoV能在全球中流行传播并能根据不同地域状况及季节变化而[54]出现不同的流行模式。本研究发现在7年间广州地区HCoV最高阳性率多分布在春季[68,71]与秋季，这与其他已发表的文章发现多分布于春季与冬季不完全符合。本研究也发现了四种HCoV亚型有不同的季节分布特征。尽管OC43有两个阳性率高峰出现在2012年、2013年7月，229E，NL63和OC43阳性率高峰多发生于广州地区的春季与秋季。其他研究显示在香港地区NL63，OC43阳性率高峰发生在2005年～2007年的秋季与冬[77]季，但是在同地区的2004年～2005年，OC43与HKU1阳性率高峰却发现分布在冬季[66][71]和NL63阳性率高峰发现在夏季与秋季。Gaunt在美国地区3年的分析中发现了229E，OC43和HKU1有不同的季节分布特征。229E阳性高峰发生在冬季，OC43阳性高峰发生在春季与秋季，HKU1发生在夏季。所以HCoV阳性率季节分布很明显的收地域位置及时间变化的影响。至于临床症状分析，本研究分别作了HCoV单重感染症状与HCoV与其他呼吸道病毒共感染症状的对比和做了HCoV不同分型间的临床症状对比，临床症状包括上呼吸道症状，流感样症状，下呼吸道症状。本研究结果提示HCoV能引起广泛的呼吸道疾病。但是除了“不正常肺呼吸”及“高热”外，在HCoV单重感染与HCoV与其他呼吸道病毒共感染症状比对中并没有其他显著差异的临床症状。HCoV单重感染患儿有“不正常肺呼吸”(p=0.043)症状的比例比HCoV与其他呼吸道病毒共感染显著要多。进一步的说，因为在HCoV不同分型比较中OC43患儿有“不正常肺呼吸”症状的比例最高(p=0.002)，所以OC43感染可能是导致“不正常肺呼吸”的主要诱因(表2)。同样的，Jina[64]Lee也发现NL63和OC43与小儿下呼吸道感染有关，但是OC43与RSV等其他病原体不同，较少机会导致严重下呼吸道感染。另外，HCoV与其他呼吸道病毒共感染的患儿有“高热”症状的比例显著比HCoV单重感染的高(p=0.014)，这表明了其他的病原体更有可能导致“高热”。最近的文章也报道过HCoV主要会发生上呼吸道临床症状，包[51,78][51,55]括高热，咳嗽，咽喉痛和头痛，偶尔有肺炎及支气管炎等下呼吸道症状。在这研究中，我们为了了解不同分型HCoV的流行情况及临床特征收集了大量的及长期的关于HCoV流行病学信息。但是我们的分析是基于咽拭子的检测，这可能对下呼吸道感染的患儿有一定的局限性。在下呼吸道感染研究中，支气管肺泡灌洗液的检测更有说服力，但是在普通的流行病学分析中使用支气管肺泡灌洗液对于患儿来说是很难获取并且是有害的。另外，缺乏对照分组包括健康人群及HCoV阴性的患儿有32 第二部分四型人冠状病毒流行病学分析可能导致上述评价有所限制。总的来说，本研究能深入分析HCoV流行病学及探究其临床意义。结论广州地区总HCoV主要感染人群是7～12个月的年龄段的儿童，重点防控时间在春季及秋季。其中，OC43主要感染人群是7～12个月的年龄段的儿童，重点防控时间在春季及秋季，229E主要感染人群是4～6个月的年龄段的儿童，重点防控时间在春季，NL63主要感染人群是7～12个月的年龄段的儿童，重点防控时间在秋季，而HKU1重点防控时间在夏季。33 广州医科大学硕士学位论文第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发材料与方法1材料1.1质粒1.1.1质粒pcDNA3.1(+)所用表达质粒是pcDNA3.1(+)，购自generayBiotech公司。该质粒主要涉及用于在哺乳动物宿主中瞬时表达及稳定表达。pcDNA3.1(+)含有CMV启动子，SV40启动子，新霉素抗性基因，用于细胞转染后加药筛选，含有pUC复制起始点和Ampicillin抗性基因，用于质粒在细菌中的扩增及阳性克隆的筛选。图1pcDNA3.1(+)载体结构图1.1.2质粒pLV-EF1a-EGFP(2A)PuropLV-EF1a-EGFP(2A)Puro载体是基于HIV1的慢病毒基因过表达载体，采用EF1a启动子启动目的基因的表达，还有PGK启动子驱动表达Puromycin抗性基因和EGFP34 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发基因。可以使用Puromycin筛选出稳定过表达目的基因的细胞。EGFP基因有利于判断病毒包装效率以及感染效率，同时也有助于稳定细胞的筛选。图2pLV-EF1a-EGFP(2A)Puro载体结构图1.1.3质粒Pa-L5，Pa-H2由广东和信健康科技有限公司李小锋教授惠赠，Pa-L5含有人源性抗体轻链恒定区基因及轻链信号肽，用于插入鼠源性mAb轻链可变区基因，构建L链。Pa-H2含有人源性抗体基因重链恒定区基因及重链信号肽，用于插入鼠源性mAb重链可变区基因，构建H链。1.1.4pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为D101B。pMD18-T载体全长2692bp。pUC复制起点：873～1461bp；多克隆位点：399～461bp；T-A克隆位点：425bp；氨苄青霉素抗性基因序列：1632～2492bp；LacZа-peptide序列：146～475bp；测序引物结合位点：BcaBESTSequencingPrimerM13-47bindingsite,352～375bp；BcaBESTSequencingPrimerRV-Mbindingsite，484～507bp，见图3。用于钓取鼠源性mAb轻重链可变区基因。35 广州医科大学硕士学位论文图3pMD18-T载体结构图1.2细胞株1.2.1抗HAdv-3杂交瘤细胞株3D7由广州锐达生物科技有限公司李晨阳教授制备，保存及惠赠。1.2.2HEK-293细胞株由广州锐达生物科技有限公司李晨阳教授惠赠。1.3病毒株Ad3EGFP：重组3型腺病毒载体。本发明所构建的基于人HAdv3E3区缺失并表达有增强型绿色荧光蛋白的腺病毒载体，能表达HAdv3基因组和增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒。1.3耗材及生化试剂试剂生产厂家TRIzolReagentInvitrogenPrimeScript™RT-PCRKit大连宝生物工程公司M-MLV逆转录酶PromegaoligodT大连宝生物工程公司randomprimer大连宝生物工程公司RNAinhibitor大连宝生物工程公司EXtaq酶Promega胶回收试剂盒Axygen36 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发质粒小量抽提试剂盒AxygenPCR产物回收试剂盒Axygen质粒中量抽提试剂盒QIAGENT4连接酶大连宝生物工程公司SacI限制性内切酶大连宝生物工程公司HindIII限制性内切酶大连宝生物工程公司BamHI限制性内切酶大连宝生物工程公司EcoRI限制性内切酶大连宝生物工程公司XhoI限制性内切酶大连宝生物工程公司NheI限制性内切酶大连宝生物工程公司TMLipofectamineLTXwithPlusInvitrogenreagentsDMEM培养基GIBCORPMI-1640培养基GIBCOCHOFreestyleExpressionMedium无GIBCO血清培养基PBSGIBCO胎牛血清GIBCO0.25%胰酶/EDTA消化液GIBCO青链霉素双抗（100×）GIBCOPuromysinGIBCOHRP标记的山羊抗鼠IgG（H+L）ProteinTech化学发光底物杭州埃夫朗生化制品有限公司PrestainedColorProteinMarker生工生物工程（上海）股份有限公司PVDF膜AmershamBiosciences氨苄青霉素广州国奥生物技术公司卡那霉素广州国奥生物技术公司BSA广州国奥生物技术公司脱脂牛奶广州国奥生物技术公司琼脂糖广州国奥生物技术公司37 广州医科大学硕士学位论文胰化蛋白胨OXOID酵母提取物OXOID384孔ELISA板Corning96孔/24孔/6孔细胞培养板Corning100mm细胞培养皿CorningC8LockweLLLµmiwhitemaxisorpThermoScientificELISA板22T25cm、T75cm培养瓶海狸生物公司1.4仪器设备及生产厂家仪器设备名称生产厂家琼脂糖凝胶电泳系统Bio-Rad凝胶扫描成像系统Bio-Rad湿法蛋白印迹转移电泳系统Bio-RadSDS-PAGE电泳系统Bio-RadTMBio-Rad电转仪MicroPulser电击杯Bio-Rad倒置荧光显微镜OlympusPCR仪Biometra隔水式恒温CO2细胞培养箱松下电器有限公司-80℃超低温冰箱合肥美菱股份有限公司台式低速离心机安徽中科中佳科学仪器公司台式低速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器公司高速冷冻离心机BECKMAN超速冷冻离心机BECKMAN超纯水仪广州市深华生物技术有限公司多功能酶标仪BioTek微量核酸蛋白分析仪Nanodrop2000ThermoScientificDu800紫外分光光度计BECKMAN超净工作台苏州安泰空气技术有限公司38 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发生物安全柜ESCOChemstudio多功能成像仪Analytikjena1.5引物用于钓取鼠源性mAb轻链可变区基因引物3D7Vκ1F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATCCAGCTGACTCAGCC-3’3D7Vκ2F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTTCTCWCCCAGTC-3’3D7Vκ3F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTGMTMACTCAGTC-3’3D7Vκ4F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTGYTRACACAGTC-3’3D7Vκ5F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTRATGACMCAGTC-3’3D7Vκ6F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTMAGATRAMCCAGTC-3’3D7Vκ7F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTCAGATGAYDCAGTC-3’3D7Vκ8F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATYCAGATGACACAGAC-3’3D7Vκ9F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTTCTCAWCCAGTC-3’3D7Vκ10F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGWGCTSACCCAATC-3’3D7Vκ11F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTSTRATGACCCARTC-3’3D7Vκ12F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYRTTKTGATGACCCARAC-3’3D7Vκ13F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTGATGACBCAGKC-3’3D7Vκ14F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTGATAACYCAGGA-3’39 广州医科大学硕士学位论文3D7Vκ15F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTGATGACCCAGWT-3’3D7Vκ16F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTGTGATGACACAACC-3’3D7Vκ17F5’-GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAYATTTTGCTGACTCAGTC-3’3D7Vκ1R5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCAGAGGATTTKATTTCCAGYTTGGTCCC-3’3D7Vκ2R5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCAGAGGATTTTATTTCCAACTTTGTCCC-3’3D7Vκ3R5’-GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCAGAGGATTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3’用于钓取鼠源性mAb重链可变区基因引物3D7VH1F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTC-3’3D7VH2F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTBCAGCTBCAGCAGTC-3’3D7VH3F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGCAGCTGAAGSASTC-3’3D7VH4F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTCCARCTGCAACARTC-3’3D7VH5F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTYCAGCTBCAGCARTC-3’3D7VH6F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTYCARCTGCAGCAGTC-3’3D7VH7F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTCCACGTGAAGCAGTC-3’3D7VH8F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAASSTGGTGGAATC-3’3D7VH9F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAWGYTGGTGGAGTC-3’3D7VH10F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGCAGSKGGTG40 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发GAGTC-3’3D7VH11F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGCAMCTGGTGGAGTC-3’3D7VH12F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAAGCTGATGGARTC-3’3D7VH13F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGCARCTTGTTGAGTC-3’3D7VH14F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTRAAGCTTGTTGAGTC-3’3D7VH15F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAARSTTGAGGAGTC-3’3D7VH16F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTTACTCTRAAAGWGTSTG-3’3D7VH17F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTCCAACTVCAGCARCC-3’3D7VH18F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAACTTGGAAGTGTC-3’3D7VH19F5’-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAAGGTCATCGAGTC-3’3D7VH1R5’-CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGACAGATGGGGSTGTYGTTTTGGC-3’3D7VH2R5’-CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGACAGATGGGGCTGTTGTTGT-3’3D7VH3R5’-CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGACATTTGGGAAGGACTGACTCTC-3’扩增Vκ-4的引物(用于克隆至Pa-L5，与人源性抗体恒定区基因序列连接)PaLVκF5’-AATTGAGCTCGACATTGTGATGACCCAATC-3’PaLVκR5’-TCTCAAGCTTGGTAACCACCGCCCGAGCCACCG-3’扩增L基因的引物(用于克隆至pcDNA3.1-3D7L载体)PCLF5’-GCTCGGATCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCT-3’PCLR5’-TGCAGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’41 广州医科大学硕士学位论文扩增VH-3的引物(用于克隆至Pa-H2，与人源性抗体恒定区基因序列连接)PaHVHF5’-GCTGCTCGAGGAGGTGCAGCTGCAGCAGTC-3’PaHVHR5’-CTTGGTGCTAGCCTGGCCGGCCTGGCCACTAG-3’扩增H基因的引物(用于克隆至pcDNA3.1-3D7H载体)PCHF5’-ACTTAAGCTTGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCT-3’PCHR5’-TAGTGGATCCCTACTGCGTGTAGTGGT-3’2方法2.1扩增mAb细胞株中和抗体轻重链可变区基因序列2.1.1RNA提取操作步骤：1)复苏杂交瘤细胞3D7于T25培养瓶中，在含10%FBS的1640培养基中进行培养；2)待细胞生长状态良好后，用吸管吹下细胞并转入50ml离心管中，1000rpm×5min；3)弃上清，用1640培养液洗细胞一次，1000rpm×5min；4)吸取1.5mlTRIzoL裂解细胞，用吸管反复吹打；5)离心管室温静置5min，然后加入0.3ml氯仿，剧烈混匀，室温放置3min;6)14000rpm，4℃离心15min，取上层无色水相至一新的EP管中，加入2/3体积异丙醇，室温孵育10min，14000rpm，4℃离心10min；7)弃上清，用1ml75%的乙醇洗涤一次，14000rpm，4℃离心10min；弃上清，于烘箱烘干RNA沉淀。用60μlDEPC水溶解RNA，放-70℃冰箱保存。2.1.2总RNA逆转录cDNA：1)在0.2mlEP管中加入以下体系RNA1μlM-MLV5×buffer5μldNTP（2.5mM）2.5μloligodT(100pmol/ul)1μlrandomprimer(100pmol/ul)1μlDEPC水to13μl2)65℃放置10min；42 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发冰上放置15min；3)上述反应体系加入如下加入M-MLVRT酶1μl，RNAinhibitor1μl4)在PCR反应仪中42℃反应1h2.1.3利用特异性引物(Vκ引物：3D7Vκ1F~3D7Vκ17F，3D7Vκ1R~3D7Vκ3R，VH引物：3D7VH1F~3D7VH19F，3D7VH1R～3D7VH3R)对鼠源性mAb可变区基因进行扩增。1)加入以下体系：Extaq(promega)1μl10×buffer1.5μldNTP(2.5mM)1.5μlcDNA2μlforwardprimer(500nM)1μlreverseprimer(500nM)1μlddH2O7μl2)PCR程序95℃5min95℃15s54℃30s35cycle72℃1min72℃10min2.1.4载体、片段的酶切及连接扩增后的Vκ与VH基因产物用Axygen胶回收试剂盒回收。回收后的Vκ与VH基因分别与pMD18-T连接。连接体系：10×T4buffer1μlpMD18-T载体1μl目的基因8μlT4连接酶1μl37℃过夜连接2.1.5对该连接物进行电转化，并挑取单克隆，测序。43 广州医科大学硕士学位论文1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2)将0.1cm的电极杯置于冰上预冷。3)取1μl纯化后的质粒加入解冻的感受态细胞中，小心混匀，冰上放置。4)打开电转仪，调至ECO1，调节电压为2.1KV。5)将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6)将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入500μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。7)37℃，160rpm复苏30min。8)取100μl转化产物并加入4ul200mg/mlIPTG，40ul20mg/mlx-gal在160μlLB平板上涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30%的甘油后混匀－80℃保存。9)挑取单菌落，14h培养，提取质粒并测序。2.2构建抗HAdv-3鼠/人嵌合中和抗体的真核表达载体2.2.1鼠源性单克隆中和抗体轻链可变区序列与人源性抗体轻链恒定区序列连接1)鼠源性轻链可变区基因Vκ-4由引物PaLVκF/PaLVκR扩增，并通过SacI/HindIII限制性酶切位点克隆至Pa-L5载体中，Pa-L5载体含有人源性抗体轻链恒定区序列及人源性轻链信号肽。2)酶切体系(40μl)：Vκ-4gene30μlPa-L532μl(100ng/μl)10×buffer4μl10×buffer4μlSacI2μlSacI2μlHindIII2μlHindIII2μlH2O2μl37℃酶2h37℃酶切2hVκ-4gene通过跑2%胶回收Pa-L5通过跑1%胶回收3)连接体系(20μl)：10×buffer2μlVκ-4gene15μlPa-L53μlT4连接酶0.5μl44 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发37℃过夜连接。4)第二天进行电转化挑单克隆，培养一天后提取质粒。该质粒通过酶切进行鉴定。Vκ-4酶切鉴定体系(15μl)：质粒7.5μl10×buffer1.5μlSacI0.5μlHindIII0.5μlH2O5μlCL酶切鉴定体系(15μl)：质粒7.5μl10×buffer1.5μlEcoRI0.5μlHindIII0.5μlH2O5μlL酶切鉴定体系(15μl)：质粒7.5μl10×buffer1.5μlSacI0.5μlEcoRI0.5μlH2O5μl37℃酶切30min，跑胶观察目标条带。2.2.2构建pcDNA3.1-3D7L载体1)Pa-L5载体中的L链包括轻链信号肽，鼠源性单克隆中和抗体轻链(Vκ-4)及人源抗体轻链恒定区序列(CL)由引物PCLF/PCLR扩增，并通过BamHI/EcoRI限制性酶切位点克隆至pcDNA3.1载体。2)酶切体系(40μl)：L30μlpcDNA3.132μl(100ng/μl)45 广州医科大学硕士学位论文10×buffer4μl10×buffer4μlBamHI2μlBamHI2μlEcoRI2μlEcoRI2μlH2O2μl37℃酶切2h37℃酶切2hL通过跑2%胶回收pcDNA3.1通过跑1%胶回收3)连接体系(20μl)：10×buffer：2μlL15μlpcDNA3.13μlT4连接酶0.5μl37℃过夜连接。4)第二天进行电转化挑单克隆，培养一天后提取质粒。该质粒通过酶切进行鉴定。酶切鉴定体系(15μl)：质粒7.5μl10×buffer1.5μlBamHI0.5μlEcoRI0.5μlH2O5μl37℃酶切30min，跑胶观察目标条带。2.2.3鼠源性单克隆中和抗体重链可变区基因与人源性抗体重链恒定区基因连接1)重链可变区基因(VH-3)由引物PaHVHF/PaHVHR扩增，并通过XhoI/NheI限制性酶切位点插入Pa-H2载体中，Pa-H2载体含有人源性抗体重链恒定区基因及人源性重链信号肽。2)酶切体系(40μl)：VH-3gene30μlPa-H232μl(100ng/μl)10×buffer4μl10×buffer4μlXhoI2μlXhoI2μlNheI2μlNheI2μlH2O2μl46 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发37℃酶切2h37℃酶切2hVH-3gene通过跑2%胶回收Pa-H2通过跑1%胶回收3)连接体系(20μl)：10×buffer2μlVH-3gene15μlPa-H23μlT4连接酶0.5μl37℃过夜连接。4)第二天进行电转化挑单克隆，培养一天后提取质粒。该质粒通过酶切进行鉴定。VH酶切鉴定体系(15μl)：质粒7.5μl10×buffer1.5μlXhoI0.5μlNheI0.5μlH2O5μlCH酶切鉴定体系(15μl)：质粒7.5μl10×buffer1.5μlBamHI0.5μlNheI0.5μlH2O5μlH酶切鉴定体系(15μl)：质粒7.5μl10×buffer1.5μlBamHI0.5μlXhoI0.5μlH2O5μl37℃酶切30min，跑胶观察目标条带。2.2.4构建pcDNA3.1-3D7H载体47 广州医科大学硕士学位论文1)Pa-H2载体中H链包括重链信号肽，鼠源性mAb重链(VH-3)及人源性抗体重链恒定区基因(CH)由引物PCHF/PCHR扩增，并通过HindIII/BamHI限制性酶切位点插入pcDNA3.1载体。2)酶切体系(40μl)：H30μlpcDNA3.132μl(100ng/μl)10×buffer4μl10×buffer4μlBamHI2μlBamHI2μlHindIII2μlHindIII2μlH2O2μl37℃酶切2h37℃酶切2hH通过跑2%胶回收pcDNA3.1通过跑1%胶回收3)连接体系(20μl)：10×buffer2μlH15μlpcDNA3.13μlT4连接酶0.5μl37℃过夜连接。4)第二天进行电转化挑单克隆，培养一天后提取质粒。该质粒通过酶切进行鉴定。酶切鉴定体系(15μl)：质粒7.5μl10×buffer1.5μlBamHI0.5μlHindIII0.5μlH2O5μl37℃酶切30min，跑胶观察目标条带。2.2.5更换信号肽2.2.5更换pcDNA3.1-3D7L中轻链信号肽1)合成人骨粘连蛋白(OSTE)信号肽(艾基)替换pcDNA3.1-3D7L中轻链信号肽。pcDNA3.1-3D7L载体示意图(图4)。OSTE信号肽核苷酸序列为：ATGAGGGCCTGGATCTTCTTTCTCCTTTGCCTGGCCGGGAGGGCCTTGGCA。对应48 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发的氨基酸序列：MRAWIFFLLCLAGRALA。2)合成人前胰蛋白酶(PPT)信号肽(艾基)替换pcDNA3.1-3D7H中重链信号肽。pcDNA3.1-3D7H载体示意图(图5)。PPT信号肽核苷酸序列为：ATGGTGTCTGCACTTCTGATCCTAGCTCTTGTTGGAGCTGCAGTTGCTGACTACAAAGACGATGACGACAAG。对应的氨基酸序列：MVSALLILALVGAAVADYKDDDDK。HindIII(912)blapromoterblapromoterBamHI(930)Amp(R)CMVpromoterKOZAKAmp(R)CMVpromoterKOZAKT7promoterPPTLeaderT7promoterOSTELeader3D7VH3D7VKpUCoriginHumanCH1pcDNA3.1(+)-3D7-HPPTpcDNA3.1(+)-3D7-LOSTEHumanCL6850bphingeregionpUCorigin6176bpHumanCH2BGHpAEcoRI(1701)SV40pAHumanCH3SV40pABGHpAf1originNeo(R)SV40earlypromoterf1originSV40earlypromoterBamHI(2352)Neo(R)EcoRI(2375)图4pcDNA3.1-3D7L载体示意图图5pcDNA3.1-3D7H载体示意图2.3抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体CHO-S细胞系的建立与筛选2.3.1瞬时转染把pcDNA3.1-3D7L和pcDNA3.1-3D7H质粒利用LipofectAMINEPLUS转染试剂盒以1：1比例转染至CHO-S细胞。5第1天：均匀铺CHO细胞于6孔板，细胞计数：4×10/ml第2天：配制A液(每孔)：150μlopti-men+5μlLipofectAMINE，静置10min配制B液(每孔)：150μlopti-men+2.4μgDNA+5μlPLUS，静置10minA液与B液混合，静置10min，利用800μl/每孔的opti-men换取已铺细胞的培养基，培养6h后，每孔替换2ml含5%FBS的CHO细胞freestyle无血清培养基，培养过夜。第3天：每孔替换2ml不含FBS的CHO细胞freestyle培养基，培养3～5天，收样，用CLEIA法检测抗体是否表达。2.3.2构建稳定细胞系1)转染：pcDNA3.1-3D7L，pcDNA3.1-3D7H质粒及pLV-EF1a-EGFP(2A)Puro慢病毒载体(含puromycin筛选标记)利用LipofectAMINEPLUS转染试剂盒转染至49 广州医科大学硕士学位论文CHO-S细胞。5第1天：均匀铺CHO细胞于6孔板中的其中3孔，细胞计数：4×10/ml第2天：配制A液(每孔)：150μlopti-men+5μlLipofectAMINE，静置10min。配制B液(每孔)：150μlopti-men+2.4μgDNA(1μgpcDNA3.1-3D7L+1μgpcDNA3.1-3D7H+400ngpLV-EF1a-EGFP(2A)Puro)+5μlPLUS，静置10min。A液与B液混合，静置10min，利用800μl/每孔的opti-men换取已铺细胞的培养基，培养6h后，每孔替换2ml含5%FBS的CHO细胞freestyle无血清培养基，培养过夜。并设有正常细胞对照孔，和转染载体的阴性对照孔。第4天：吸取6ml上清加入6ml含5%FBS的CHOfreestyle培养基并加入1%双抗。每孔贴壁细胞用200μl胰酶消化，5min后加入freestyle培养基终止消化，1000rpm离心10min，弃上清，把上述配好的CHO适应性培养基每孔加4ml，把3孔共12ml分成120μl/每孔分装于96孔板中。2)有限稀释法筛选克隆化两天后，细胞状态比较好，即换含有适合浓度puromysin不含FBS的CHO细胞freestyle无血清培养基培养。观察细胞状态，每3天换液一次。筛选4周左右，抗性细胞长满后每隔2～4d用CLEIA法检测抗体是否表达。结合细胞生长状态，将较高表达的细胞孔消化出，用有限稀释法进行第一次克隆化，将细胞每孔约1个接种于96孔板中，细胞孔长满后用CLEIA法检测抗体是否表达。挑选出表达量较高的孔继续进行第二次克隆化，细胞孔长满后用CLEIA法检测抗体。挑选出表达量较高的孔继续进行第三次克隆化，细胞孔长满后用CLEIA法检测抗体表达量是否提高。CLEIA检测二抗为HRP-山羊抗人IgG(H+L)抗体。当高表达孔单克隆细胞在96孔板内生长约至80%，将其转入24孔板，细胞状态稳定后转入252cm培养瓶中培养。待细胞生长至瓶底约80%后，其中3/4细胞冻存，剩余1/4细胞继续培养。2.4抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体的表达、鉴定及生物学活性检测2.4.1CLEIA建立抗体浓度标准曲线测定抗体浓度1）人抗体标准品按一定比例稀释，稀释浓度分别至45ng/ml，136ng/ml，400ng/ml，1.2μg/ml，3.6μg/ml，11μg/ml，33μg/ml，100μg/ml，并设置空白孔。2）用PBS以标准品：PBS=1：6比例稀释每孔100μl包被至ELISA孔，4℃包被过夜。50 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发3）次日用3%封闭液37℃封闭2h。4）加入1×PBST清洗3次。5）用1×PBST1:1000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)孵育1h。6）加入1×PBST清洗3次。7）加入化学发光底物(Lumino1-H2O2)，用多功能酶标仪(BioTek，SYNERGYHTX)进行分析，建立标准曲线(RLUs值=实际孔检测RLU值-空白孔检测RLU值)。瞬时转染及稳定细胞系的培养上清均按上述流程操作。2.4.2Westernblotting检测目的蛋白分别用还原和非还原Westernblotting检测培养上清的人源化抗体。1）将含有人源化抗体的上清分别在还原和非还原条件下分别用12%，8%的分离胶完成。SDS-PAGE，每孔上样量为40μl。还原条件下设定3个待测上清孔，非还原条件下设定1个待测上清孔及1个阴性对照(没有转染的细胞上清)。2）转移至PVDF膜，转膜条件为380A，120min。3）将PVDF膜放入1×TBST中清洗3次，摇床震荡，每次5min。4）在5%的封闭液中37℃封闭2h。5）取出PVDF膜将其放入1×TBST清洗3次，每次5min。6）将PVDF膜加入用1×TBST1:1000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)中37℃孵育1h。7）用1×TBST洗膜3次，每次5min。8）加入化学发光底物，用Chemstudio多功能成像仪(Analytikjena)扫描成像。2.4.3微量中和实验检测抗体中和活性1）将HEK-293细胞接种入24孔板，培养1d约至90%汇合度。-12）以含荧光信号的Ad3EGFP重组病毒株作为攻击病毒，用DMEM稀释病毒10，-2-3-410，10，10后，将100μl稀释病毒分别与100μl抗HAdv-3鼠源性mAb(阳性对照)，抗infA鼠源性mAb（阴性对照）和培养上清（待检样品）混合后37℃孵育1h。3）将孵育后的混合液分别接种到培养好的HEK-293单层细胞，37℃孵育2h。同时设置正常细胞作为未感染组对照。4）用微量移液器将每孔的混合液吸弃，加入500μl温育好的DMEM培养液继续培养，连续培养5天。5）检测：用荧光显微镜观察绿色荧光数量。51 广州医科大学硕士学位论文结果1.抗HAdv-3鼠源性mAb可变区基因的扩增将抗HAdv-3鼠源性mAb轻链及重链可变区基因特异性引物对cDNA的扩增产物进行电泳，结果如图1。由图可见，由抗HAdv-3鼠源性mAb轻链可变区基因特异性引物能扩增出Vκ片段，Vκ条带为394bp。由抗HAdv-3鼠源性mAb重链可变区基因特异性引物能扩增出VH，VH条带为409bp，结果符合预期。图1Vκ，VH扩增产物电泳图2.抗HAdv-3鼠源性mAb轻重链可变区基因酶切初步鉴定挑选阳性克隆菌提取有可能含有抗HAdv-3鼠源性mAb轻链可变区基因的质粒，使用EcoRⅠ及HindⅢ双酶切鉴定，并进行电泳，结果如图2，由图可见，6质粒样本中6样本均符合预期。图2Vκ基因酶切鉴定电泳图52 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发挑选阳性克隆菌提取有可能含有抗HAdv-3鼠源性mAb重链可变区基因的质粒，使用EcoRⅠ及HindⅢ双酶切鉴定，并进行电泳，结果如图3，由图可见，2质粒样本中3，6样本均符合预期。图3VH基因酶切鉴定电泳图3.抗HAdv-3鼠源性mAb轻重链可变区及人源性恒定区基因测序鉴定及序列分析Vκ6个质粒中轻链可变区基因同源性达84%。其中挑选Vκ-4质粒可变区基因序列输入Imgttools/IMGT/V-QUEST，进行结构分析，该基因能编码鼠源性抗体结构。结果显示：Vκ-4可变区基因与鼠源IGKV3-12*01有较高的同源性，高达90%(表1)。第1-84bp为FR1，第85-114bp编码CDR1区，第115-165bp为FR2，第166-174bp编码CDR2区，第175-282bp为FR3，第283-306bp编码CDR3区，第307-366bp为FR4。序列中含有1个半胱氨酸(黄色标记)，用于形成链间二硫键(如图4)。VH中2个质粒重链可变区基因同源性达99.7%。其中挑选VH-3质粒可变区基因序列输入Imgttools/IMGT/V-QUEST，进行结构分析，该基因能编码鼠源性抗体结构。结果显示：VH-3可变区基因与鼠源IGHV1S81*02有较高的同源性，高达90%(表2)。第1-75bp为FR1，第76-99bp编码CDR1区，第100-150bp为FR2，第151-174bp编码CDR2区，第175-288bp为FR3，第289-306bp编码CDR3区，第307-384bp为FR4。序列中含有2个半胱氨酸(黄色标记)，用于形成链间二硫键(如图5)。CL全长为：342bp(如图6)。BLAST分析表明，CL与数据库中同源性为99%,该序列名称为Homosapiensimmunoglobulinkappaconstant,mRNA(cDNAcloneIMAGE:30350264)，SequenceID:BC095490.1。53 广州医科大学硕士学位论文CH全长为：966bp(如图7)。BLAST分析表明，CH与数据库中同源性为99%。该序列名称为Homosapiensimmunoglobulinheavyconstantgamma1(G1mmarker),mRNA(cDNAcloneIMAGE:6182140)，SequenceID:BC072419.1。表1轻链可变区（Vκ-4）基因核苷酸同源性比对分析ScoreIdentityK02159MusmusIGKV3-12*01137897.25%(283/291nt)K02158MusmusIGKV3-7*01128893.81%(273/291nt)Y15968MusmusIGKV3-4*01114488.32%(257/291nt)K02160MusmusIGKV3-10*01112687.63%(255/291nt)K02162MusmusIGKV3-3*01111787.29%(254/291nt)FR1GAGCTCGACATTGTGATGACCCAATCTCCTGCTTCCTTAGCTGTAELDIVMTQSPASLAVTCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTSLGQRATISYRASKSCDR1GTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAAVSTSGYSYMHWNQQKFR2CDR2CCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAPGQPPRLLIYLVSNLFR3GAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAESGVPARFSGSGSGTGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCADFTLNIHPVEEEDAACDR3ACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGTYYCQHIRELTRSEGFR454 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发GGACAAAGTTGGAAAGAAAATCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGQSWKENPLVAVARAGTGGTTVV图4轻链可变区(Vκ-4)抗体结构表2重链可变区（VH-3）基因核苷酸同源性比对分析ScoreIdentityAF304547MusmusIGHV1S81*02121091.32%(263/288nt)AC074329MusmusIGHV1-53*01118390.28%(260/288nt)K00604MusmusIGHV1S16*01114788.89%(256/288nt)K00605MusmusIGHV1S17*01112988.19%(254/288nt)AC074329MusmusIGHV1-55*01112087.85%(253/288nt)FR1GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGACTGAAGTGGTGAAACCTGGGEVQLQQSGTEVVKPGCDR1GCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCASVTLSCKASGYTFTFR2AGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGGCAAGGCCTTSYWMHWVKQRPGQGLCDR2GAGTGGATTGGAGAAATTAATCCTGCCAACGGTCGGACTAATTACEWIGEINPANGRTNYAATGAGAAGTTCAAGAGTAAGGCCATACTGACTGTTGACAGATCCNEKFKSKAILTVDRSFR3TCCACCACAACGTTCATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGAC55 广州医科大学硕士学位论文STTTFMQLSSLTSEDCDR3TCTGCGATCTATTACTGTGCAAGATGGTTATCTTTCTGGGGCCAGSAIYYCARWLSFWGQFR4GGAACTCTGGTCACTGTCTCTGTAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTLVTVSVAKTTPPSGTCACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGVTSGQAGQ图5重链可变区(VH-3)抗体结构ACCAAGCTTGAGATCAGACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCLGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGATCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG图6人源性轻链恒定区基因GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCH1GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTHingeGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGCH2AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA56 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGTGACH3CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGTAG图7人源性轻链恒定区基因4.抗HAdv-3鼠源性抗体可变区基因与人源性抗体恒定区基因连接4.1抗HAdv-3鼠源性抗体可变区基因扩增及电泳鉴定将抗HAdv-3鼠源性抗体可变区基因扩增产物进行电泳，由图可见，Vκ片段大小约为383bp处条带，VH片段大小约为403bp处条带，结果符合预期(图8)。图8Vκ-4，VH-3扩增产物电泳图4.2Vκ-4克隆至Pa-L5载体酶切鉴定(与人源性抗体恒定区基因连接)将嵌合抗体轻链产物进行酶切及电泳鉴定，有图可见，轻链连接产物片段大小大约为732bp，Vκ-4大小大约为375bp，CL为357bp，结果符合预期(图9)。57 广州医科大学硕士学位论文图9Vκ-4插入Pa-L5酶切鉴定电泳图4.3VH-3克隆至Pa-H2载体酶切鉴定(与人源性抗体恒定区基因连接)将嵌合抗体重链产物进行酶切及电泳鉴定，有图可见，重链连接产物片段大小大约为1350bp，VH-3大小大约为384bp，CH为966bp，结果符合预期(图10)。图10VH-3插入Pa-H2酶切鉴定电泳图5.嵌合基因与表达载体的连接及酶切鉴定5.1嵌合基因扩增及电泳鉴定将L，H嵌合基因扩增产物进行电泳，由图可见，L片段大小约为714bp条带，H片段大小约为1362bp条带，结果符合预期(图11)。58 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发图11L，H基因扩增产物电泳图5.2嵌合基因克隆至表达载体酶切鉴定使用双酶切法对连接后的载体进行鉴定，把酶切产物进行电泳。由图可见，L片段大小约为786bp条带，H片段大小约为1437bp条带，结果符合预期(图12)。图12L，H基因克隆至pcDNA3.1(+)载体酶切鉴定电泳图6.信号肽测序结果6.1OSTE信号肽测序结果59 广州医科大学硕士学位论文OSTE信号肽替换轻链人源性抗体信号肽，测序结果所示，OSTE信号肽序列完全正确(如图13)。图13OSTE信号肽测序结果6.2PPT信号肽测序结果PPT信号肽替换重链人源性抗体信号肽，测序结果所示，PPT信号肽序列完全正确(如图14)。图14PPT信号肽测序结果7.抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体的表达7.1CLEIA建立抗体浓度标准曲线测定抗体浓度使用45ng/ml，136ng/ml，400ng/ml，1.2μg/ml，3.6μg/ml，11μg/ml，33μg/ml，100μg/ml等浓度并设置空白孔，建立标准曲线为图15，标准曲线方程为y=0.954x+0.197，2R=0.989。60 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发6LogRLUy=0.954x+0.1975R²=0.989432100123456LOGX(ng/ml)图15抗体浓度标准曲线7.2质粒pcDNA3.1-3D7L和pcDNA3.1-3D7H共转染后的抗体含量测定对已经转染72h后的CHO细胞上清进行CLEIA检测，结果RLUs值为200~400，根据标准曲线推算150~300ng/ml。7.3CHO稳定细胞系抗体含量测定对构建好的CHO稳定细胞系的上清进行CLEIA检测，结果RLUs值能达到20000，根据标准曲线推算19.9ug/ml。8嵌合抗体Westernblotting分析8.1嵌合抗体在还原条件下Westernblotting分析3个CHO细胞上清待测样本在还原条件下进行Westernblotting分析，如图16所示，3个样本均有两条条带，在PVDF膜上有一条条带大小约在54kD处，这是重链大小，有一条条带大小在28kD处，这是轻链大小，实验结果符合预期，证明该CHO分泌的抗体的轻重链都有分泌。61 广州医科大学硕士学位论文图16嵌合抗体还原条件WB分析8.2嵌合抗体在非还原条件下Westernblotting分析一个CHO细胞上清待测样本及阴性对照(没转染的CHO细胞培养上清)在非还原条件下Westernblotting分析，如图17所示，CHO细胞上清待测样本在PVDF膜上在140kD处有一条条带，实验结果符合预期，证明有完整抗体分泌。图17嵌合抗体非还原条件WB分析9体外微量中和实验该中和实验采用固定血清稀释病毒法检测该抗体的中和活性。以下结果显示培养62 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发-35天后浓度为10的HAdv-3病毒的中和效果，取含抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体浓度为20ug/ml的上清与抗infA鼠源性mAb(阴性血清对照，稀释至20ug/ml)进行比较，按照中和实验方法并观察荧光数量以检测其中和活性，如图18所示，接种含抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体浓度为20ug/ml的上清的病毒颗粒荧光明显比阴性对照少，但相对于抗HAdv-3鼠源性mAb阳性血清对照(稀释至20ug/ml)能完全中和的结果，抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体上清中和活性作用显得相对较弱。但取含抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体浓度为10ug/ml的上清与抗infA鼠源性mAb(阴性血清对照，稀释至10ug/ml)进行比较，按照中和实验方法并观察荧光数量以检测其中和活性，如图19所示，接种含抗HAdv-3鼠/人嵌合抗体浓度为10ug/ml的上清的病毒颗粒荧光明显比阴性对照多得多。证明浓度低的抗体有可能引起抗体依赖增强作用(ADE)。浓度为20ug/ml培养上清+荧抗infA鼠源性mAb+荧光ADV3光ADV3孔(阴性血清对照)第5天抗HAdv-3鼠源性mAb+荧光ADV3空白对照(阳性血清对照)图18体外微量中和实验163 广州医科大学硕士学位论文浓度为10ug/ml培养上清+荧抗infA鼠源性mAb+荧光ADV3光ADV3孔(阴性血清对照)第5天空白对照抗HAdv-3鼠源性mAb+荧光ADV3空白对照(阳性血清对照)图19体外微量中和实验2讨论随着分子生物学的发展进步，鼠源性抗体的改造正往全人源的方向前进，但是否人源化程度越高就好，这尚存广泛的争论。鼠源性抗体的人源化改造后最大的问题是抗体的亲和力减弱甚至丧失，使鼠源性抗体的生物活性也相应的降低，既然药效大幅减弱，人源化改造也就没有了意义。而鼠/人嵌合抗体的改造原理主要将鼠源性抗体的可变区基因整段钓取出来和人源性恒定区基因进行连接，在不改变鼠源性抗体可变区的三维结构下，移植到人的抗体恒定区，这做法不仅能尽可能保留各个结构域的空间结构，保持亲本的亲和力及生物活性，而且实验操作也较为简单，容易实现人源化改造。本课题组已构建3、7型嵌合腺病毒rAdMHE3，并以此作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术分别筛选出能分泌针对HAdV-3的中和抗体的单克隆杂交瘤细胞株3D7，64 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发[79]并证实该细胞株分泌的mAb有明显的中和活性，所以本研究主要以该杂交瘤细胞株3D7为材料，构建HAdv-3鼠/人嵌合IgG抗体，主要思路将分泌抗HAdv-3中和抗体的鼠源性mAb杂交瘤细胞株3D7的轻链，重链可变区基因分别和人源性抗体的轻链(CL)及重链(CH1，hingeregion，CH2，CH3)恒定区基因进行连接，构建鼠/人嵌合轻重链基因并克隆至真核表达载体。经过此改造，鼠/人嵌合抗体的鼠源性减少了70%，进而降低了亲本mAb免疫原性，能更好地避免HAMA反应，同时为后续的人源化奠定了基础。嵌合抗体的改造虽然实验操作相对于其他人源化改造较为简单，但是有些实验步骤也较为关键，不容有失。其中钓取正确的鼠源性抗体轻重链可变区基因是关键的一[80,81]步。目前能钓取杂交瘤细胞抗体可变区基因主要有3种方法：1.根据抗体可变区的FR1和FR4的保守基因设计相应的简并引物。2.根据信号肽的相对保守的基因设计相应的简并引物。3.5’RACE法。第一种方法成功率较高，但由于多条简并引物[82]的缘故，有可能改变抗体框架结构。MichaelJ表明了抗体框架结构(FR)能影响抗体高变区(CDR)的结构，使抗体的亲和力也发生改变。第二种方法好处是可以获得正确的抗体可变区基因，但是由于信号的肽的保守性较差，需要设计更多的简并引物才能把该抗体可变区基因钓取出来，难度也相应的增加。本研究采用第一种方法成功钓取抗体轻重链可变区基因，但是由于有多条简并引物，导致钓取出来的抗体轻重链可变区基因的FR1区有几个氨基酸发生改变，这有可能使抗体结构发生改变。有研究[83]表明，重链可变区基因FR1中H6，H7，H10氨基酸或者轻链可变区基因FR1中[84]L5，FR3L71等变化确实能影响抗体结构等变化，所以参考上述文献，本研究也从轻重链中各挑选了一条较为合适的基因序列(Vκ-4，VH-3)进行改造。选择好鼠源性抗体轻重链可变区基因后，也需要考虑恒定区基因类型。不同的抗体恒定区与补体和受体的相互作用和触发细胞破坏的功能也不完全相同。在IgG不同亚类中，结合C1q的能力大小也不同：IgG3>IgG1>IgG2，而IgG4不能跟C1q结合。在补体活化方面，IgG1比其他亚型要强，而且能够触发ADCC的能力也比IgG3强，考虑到病毒感染细胞时机体能产生强而有效的免疫效应，所以本研究采用IgG1亚型恒定区。一条抗体序列除了可变区及恒定区外，还有一种元件需要选择，该元件的选择影响到该抗体能否正常分泌及分泌量多少，这元件就是信号肽。信号肽作用是指导蛋白质的跨膜转移或定位，因此如果要成功获得正确结构的组合蛋白，那么信号肽的选择65 广州医科大学硕士学位论文[85,86]是十分关键。很多研究表明：许多信号肽在不同物种中功能可以互换的，换句话[87]说，不同的信号肽能在蛋白分泌的过程中起不同的作用。在抗体分泌方面，有研究[88]也表明，以市面上单抗类治疗性药物为研究对象，例如：赫塞汀(Herceptin)，阿瓦斯丁(Avastin)等，通过改变它们的信号肽发现它们的分泌量也发生显著的变化。本研究通过尝试把轻链，重链信号肽分别替换为人白介素-2信号肽(IL-2Leader)，人骨粘连蛋白信号肽(OSTELeader)，人前胰蛋白酶信号肽(PPTLeader)等信号肽，并进行CHO细胞瞬时转染，结果显示：OSTELeader替换了轻链信号肽及PPTLeader替换了重链信号肽，分泌效果相对较好，瞬时转染分泌量最高时达300ng/ml。到目前为止，能用于抗体分泌的表达系统有很多，例如大肠杆菌表达系统，酵母菌表达系统，昆虫表达系统，哺乳动物表达系统等。大肠杆菌表达系统为原核表达系统，虽然具有分泌量高，成本较低的优点，但是对于糖蛋白类生物药品而言，由于原核生物表达产物缺乏进行糖基化等修饰的机制，常影响该药物的免疫原性及生物活性[89,90]。酵母及昆虫细胞虽然有糖基化功能，但是这类生物含有的糖基化酶与哺乳动物表达的不同。糖基化的不同，形成的寡糖链也不同，均容易被机体识别及很快的清除，[91]影响药效。现代治疗性抗体的生产主要使用哺乳动物表达系统，常用的宿主细胞包括：293T细胞，CHO细胞，SP2/0细胞，Vero细胞等，其中CHO细胞使用较为广泛。主要的优点是有正确的糖基化作用，表达的重组蛋白结构及功能与天然蛋白较为相近。本研究使用了CHO-S细胞作为宿主细胞，经过westernblottig分析，该细胞所分泌的抗体结构是正确的。据报道CHO细胞染色体上大概有15000个整合位点，转录活性位点却只有15个左右。因此，外源基因通过随机方式插入转录活性位点，正确的概率最多才有1/1000。本研究采用puromycin经过4周筛选及3轮的克隆化，我们得到2株表达较高的细胞，表达最高时达20ug/ml。但由于克隆化程度不高，所表达该抗体的单克隆细胞中嵌合抗体基因丢失，导致抗体分泌量随着细胞培养时间增长而不断降低。所以随后工作应采取高效的筛选方法，例如：有限稀释克隆法与流式细胞分选技术相结合，提高筛选出高分泌细胞株的几率。[92]目前能检测抗体中和活性的方法有多种，包括：微量细胞中和实验，PAP[93][94](Peroxidase-anti-Peroxidase)法，空斑减少中和实验(PRNT)，病毒复制减少中和[95]实验。本研究主要采用微量中和实验方法中的固定血清稀释病毒法检测该抗体的中和活性，利用梯度浓度带有eGFP绿色荧光的HAdv-3与含有一定浓度的抗体上清混合66 第三部分抗人3型腺病毒人源化中和抗体研发并接种到正常的HEK-293上，培养5天后通过荧光显微镜观察荧光的多少，即能获得-3中和活性的初步结果。该结果显示浓度为10的HAdv-3病毒的中和效果，抗体浓度达到20μg/ml，病毒荧光明显比阴性对照少得多，但对比起阳性对照，中和活性明显减弱了，这有可能与鼠源性抗体可变区FR1区氨基酸改变有关。当抗体浓度只有10μg/ml或更少时，病毒荧光明显比阴性对照多得多，同样浓度的阳性对照仍然能中和所有HAdv-3。上述现象表明，该低浓度嵌合抗体有可能引发了抗体依赖增强作用(ADE)。ADE现象指针对病毒表面蛋白的特异性抗体常常可以中和病毒,使其失去感染细胞的能力，然而在有些情况下，抗体在病毒感染过程中却发挥相反的作用：它们协助病毒[96]进入靶细胞，提高感染率。近年来研究发现，ADE现象确实在众多病毒中被发现，其机制有多种并且尚没完全明确。Halstead等表明常见的ADE作用是通过抗体上Fc与细胞表面FcR的相互作用使病毒-抗体复合物与含有FcR的细胞(单核细胞，具噬细胞，B细胞等)结合，使病毒粘附在细胞的表面，从而使该细胞对病毒的摄入增强，然后可能因为病毒不能立即被灭活而导致病毒在细胞中复制扩散。也有研究发现猪群受到PRRSV(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome)病毒感染后,群体内免疫水平参差不齐,不同个体发生ADE差别很大;另外,从母源抗体获得对PRRSV被动免疫的子代,一旦抗体水平下降至保护性水平以下(亚中和水平)，PRRSV在小猪体内表现ADE。还有另外一些情况，有些针对病毒的特异性抗体可能只是使病毒到达靶细胞表面，进而增进细胞与病毒受体的结合效率，有一些细胞表面分子能起到介导作用，或[97]者就是其本身的病毒受体。在本体外中和实验中，20μg/ml的抗体浓度能有效抑制病毒复制及减少病毒数量，但10μg/ml的抗体浓度却反而增强病毒的复制，表明了对于人源化抗体来说，该10μg/ml抗体浓度可能已达到亚中和滴度水平，引导病毒到达靶细胞的表面通过细胞上的某种受体而介导病毒进入细胞，导致ADE现象的发生。因为本实验瞬时转染表达浓度较低加上稳定细胞系的嵌合抗体基因的丢失，获得足够浓度的抗体已十分困难，所以后续实验将围绕如何提高细胞分泌量为重点，提高嵌合抗体的浓度。结论本研究成功构建了抗HAdv-3鼠/人嵌合中和抗体真核表达质粒，并在CHO-S细胞中稳定表达，表达的抗体也被证实有中和活性。67 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广州医科大学硕士学位论文综述治疗性抗体在病毒感染性疾病中的应用【摘要】利用抗体治疗感染性疾病具有久远的历史。随着抗体技术的不断发展，从最初的鼠源性单克隆抗体(mAb)，经过嵌合抗体、人源化抗体的阶段，发展到现在的全人源抗体。抗病毒mAb可以通过中和作用抑制病毒增殖或者通过抗体依赖细胞介导的补体依赖的细胞毒作用(CDC)、细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖的胞吞作用(ADCP)和抗体依赖细胞介导的病毒抑制作用(ADCVI)发挥作用，还可通过诱导内源性体液和细胞免疫发挥长期保护效应。针对急、慢性病毒感染的mAb的数量呈指数级增长，其中部分正在进行临床试验。针对病毒变异的问题，采用多种抗体联合使用的抗体“鸡尾酒”疗法。【关键词】病毒感染;抗病毒抗体;综述抗体用于人类疾病治疗的历史可追溯到19世纪末动物来源的抗血清用于白喉、肺炎、麻疹等传染病的早期治疗，有一定效果，但由于其成分复杂多变，同时又是异源[1]蛋白，在治疗时出现了严重的副作用。后来由于抗生素的出现并广泛使用，抗血清的治疗逐渐被弃用。直到1975年杂交瘤技术问世，使得大规模制备高特异性、高均一性抗体成为可能，因而对抗体的研究和应用带来了新的突破。抗体对于病毒感染性疾病的被动免疫治疗具有十分重要作用，它可以通过中和病毒，杀伤感染细胞，调节免疫等机制达到治疗目的。随着抗体技术的发展，已有很多学者进行抗病毒抗体的研[2]究，目的用于病毒感染性疾病的被动治疗与预防。以下对治疗性抗体的研究进展及其在病毒感染性疾病中的应用进行综述。1抗体的抗病毒作用机制1.1中和作用抗体的中和作用是指在体外特定条件下抗体结合并使病毒失去感染性的能力。抗体用于病毒感染性疾病治疗的主要机制就是中和作用。大多数在体外具有中和作用的抗体在体内可以保护动物，但是这种保护机制很复杂，包括抗体与天然免疫系统的细胞和分子的相互作用。抗体通过几种不同的机制发挥中和作用，包括:抗体可以聚集74 综述病毒减少感染性颗粒的数目、使病毒颗粒失去稳定性、抑制病毒与靶细胞的结合、抑制病毒颗粒的脂膜与宿主细胞膜的融合、抑制非包膜病毒的基因组进入胞质、与新生[3]的病毒颗粒结合阻止其出芽释放至细胞表面等。例如目前研究的用于艾滋病治疗的抗体，针对人类免疫缺陷病毒糖蛋白120(humanimmunodeficiencyvirusglycoprotein[4]120，HIVgp120)上CD4结合位点的抗CD4[或抗CC趋化因子受体5/CXC趋化因子[5]受体4(CCchemokinereceptor5/CXCchemokinereceptor4，CCR5/CXCR4)]的抗体都是通过阻断病毒与靶细胞的结合来发挥作用。抗A型流感病毒神经氨酸酶的单克隆[6]抗体(monoclonalantibody，mAb)可以阻止被感染的细胞释放病毒颗粒。1.2免疫效应功能抗体通过对靶细胞进行“调理(opsonize)”，进而激活免疫效应细胞攻击靶细胞。主要包括两个方面，即抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)、抗体依赖的胞吞作用(antibody-dependentcellularphagocytosis，ADCP)和补体依赖的细胞毒作用(complement-dependentcytotoxicity，CDC)。ADCC是抗体通过与免疫效应细胞表面的Fcγ受体(Fc-gammareceptor，FcγR)结合，将效应细胞与被抗体识别的靶细胞交联，效应细胞释放穿孔素和颗粒酶，引起靶细胞裂解或被吞噬细胞吞噬。能表达Fcγ受体并介导ADCC的免疫细胞有自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞和某些T细胞或嗜酸性粒细胞。某些情况下，诱导免疫效应功能在抗体治疗作用中起关键作用。另外，抗体Fc段与Fc[7-9]γ受体也可以通过抗体依赖细胞介导的病毒抑制作用(antibody-dependentcell-mediatedvirusinhibition，ADCVI)直接影响病毒的增殖。CDC是由抗体直接诱导的另一种杀伤靶细胞的方式。当抗原抗体形成复合物后，位于抗体Fc段的多个补体结合位点暴露出来，从而激活补体。补体活化后可以产生多种生物学效应，如细胞裂解、免疫黏附及调理作用、促进炎症反应等。此外，在抗病毒治疗过程中，抗病毒抗体可以与病毒颗粒或病毒感染的细胞形成免疫复合物，被抗[10-12]原提呈细胞所识别，从而产生持续性的免疫保护效应。深入了解抗体的作用机制，对研发更佳治疗效果的抗病毒抗体具有积极作用。2治疗性抗体的研究进展及其在病毒感染性疾病中的应用75 广州医科大学硕士学位论文2.1鼠源性mAb1975年，Kohler和Milstein建立了可产生mAb的B淋巴细胞杂交瘤细胞和mAb技术，使得人们能够大量获得结构均一、纯度高、特异性强、效价高的鼠源性mAb，使得mAb在疾病诊断、治疗和基础研究中得到了长足发展。第四军医大学研制的具有中和活性的抗肾综合征出血热鼠源性mAb，已完成3期临床试验，具有良好的临床治疗效果，但由于小鼠源性mAb是异源蛋白，易诱发人抗小鼠抗体应答(humananti-mouseantibodyresponse，HAMA)，在人体内半衰期短及不能有效地活化补体和FcR相关的效应功能，使其在实际应用中尤其是疾病的治疗方面受到很大的限制。因此，有必要对其进行人源化改造。2.2鼠/人嵌合抗体为克服鼠源性mAb在临床应用中的缺陷，人们利用DNA重组技术对其进行了人源化改造。将鼠源性mAb的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出鼠人嵌合抗体，其人源化程度达到70%左右。嵌合抗体完整地保留了鼠源性mAb的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是一种脂分子，通常位于细胞膜内侧，但可暴露于有包膜病毒的表面和某些病毒[如丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)、A型和B型流感病毒、HIV1、HIV2、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒及伯钦特病毒等]感[13]染的细胞表面。暴露在细胞膜外侧的PS能使病毒逃逸宿主免疫应答，因此，美国Peregrine生物制药公司研发了一种抗PS的嵌合抗体bavituximab，目前认为该抗体有助于刺激机体免疫系统消灭病毒颗粒和受感染的细胞。临床前试验显示，bavituximab可与许多不同的包膜病毒结合，并在严重病毒感染的动物模型中表现出不凡的抗病毒活性。该公司将其作为治疗慢性HCV感染药物进行开发，并且已经完成了1a和1b期临床研究。临床试验结果对其安全性和抗病毒活性给予了肯定。关于bavituximab用于治[14]疗HCV和HIV合并感染患者的临床试验正在进行中。2.3人源化抗体由于鼠/人嵌合抗体仍保留了约30%左右的鼠源性，临床结果显示不同的嵌合抗体有着不同程度的免疫原性，因此人们通过互补决定区(complementarydeterminingregion，CDR)移植和表面重塑2种途径对鼠源性mAb进行进一步人源化改造。CDR移76 综述植，是将鼠源性mAb的CDR及某些对维持亲和力起重要作用的骨架区(frameworkregion，FR)氨基酸共同移入人抗体的相应部位构建成新抗体，这种类型的抗体也称为改型抗体，人源化程度可达90%以上，是目前人源化mAb最常用、最基本的方法。为进一步减少免疫原性，可以进一步把CDR中仅对亲和力起决定作用的氨基酸(specificitydeterminingresidues，SDR)移入人骨架区。目前经FDA认证的人源化抗体多采用这种方法制备。值得注意的是，1998年FDA批准上市了第1个用于病毒感染性疾病的具有中和活性的人源化鼠mAb帕利珠单抗(palivizumab)，该抗体主要用于严重呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)肺部感染的高危儿童。在病毒感染前或感染初期给药，能有效保护呼吸道免受由病毒引起的炎症反应的损伤。它的安全性和有效性的临床试验报告涉及支气管肺发育不良的婴幼儿、早产儿(孕龄≤35周)以及血流动力学改变的先天性心脏病患儿，该抗体对这些儿童是有益的。到目前为止，帕利珠单抗是市场上唯一一个被美国食品药品监督管理局(USFoodandDrugAdminstration，[15]FDA)批准用于病毒感染性疾病治疗的抗体。艾滋病是严重威胁人类健康的病毒性传染病，至今还无安全有效的HIV疫苗问世，因此，开发HIV治疗药物成为防治疾病的主要策略。TNX-355是人源化的IgG4型的抗CD4mAb，由于所有HIV1和宿主细胞结合都要通过CD4，因此TNX-355可阻断所有HIV1的入侵。1b期临床试验表明多剂量的TNX-355能降低HIV患者血中的病毒载量和增加CD4+T细胞的数量，在治疗过程中未见抗体的免疫原性反应和药物副作用。每周或每2周注射1次是安全的，耐受性较[16,17]好，抗病毒活性也很高，已进入2期临床试验。PRO140是一种比较有希望的CCR5抑制剂，为人源化的抗CCR5的mAb，能覆盖CCR5的多个胞外结构域，有效阻止gp120同CCR5的结合，目前已被FDA列入快速批准候选药物。在1、2期临床试验中，PRO140均表现出良好的抗病毒活性、半衰期较长、耐受性好等特点，同时未检测到[18,19]抗性病毒株的出现，在与其他CCR5小分子拮抗剂联合使用时，能产生协同增强效应。表面重塑技术，是将鼠抗体骨架区表面氨基酸残基进行人源化改造，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。人源化抗体较好地保留了亲本抗体的特征，在人体的半衰期和效应功能也更加接近于人抗体。但由于其仍至少具有10%的异源蛋白，在临床应用中可能受到不同程度77 广州医科大学硕士学位论文的限制，因而有待于进一步研制更完善的治疗性抗体——全人抗体。2.4全人抗体全人抗体是治疗性抗体的发展趋势。目前生产全人抗体的技术已达到比较成熟的阶段，主要通过2种途径来研制，即抗体库技术和转基因小鼠技术。2.4.1噬菌体抗体库20世纪90年代噬菌体展示技术(phagedisplay)被用于抗体的表达，该方法建立在噬菌体外壳能够特异性表达抗体蛋白片段的基础之上。利用该技术可有效地表达抗原结合片段(Fab)、单链抗体(singlechainfragmentvariable，scFv)及双特异抗体[20,21](diabody)。这样确定的抗体片段再经历一次体外工程，就能产生具有完整功能的人源性mAb。目前，噬菌体抗体库技术已成为人源mAb研制的重要途径和重要技术平台。它最令人瞩目的是使mAb的制备可以在体外模拟抗体的生成，达到不经细胞的免疫和杂交融合制备特异、稳定抗体的目的，成为研制人源性抗体有效、可靠的手段。在对严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severeacuterespiratorysyndrome[22,23]coronavirus，SARS-CoV)的研究中，VandenBrink等从半合成的scFv噬菌体展示文库中筛选，以IgG1分子的形式表达、纯化后获得人源mAbCR3014，该抗体可以完全阻止被感染雪豹的肺部病理改变。体外实验证实CR3014不能与重组S1片段(318～510氨基酸，包含462位点突变)结合，该位点的突变是SARS-CoV逃逸CR3014中和的突变株。因此，他们又从SARS恢复期患者血清构建的噬菌体抗体库中筛选与CR3014互补的抗体，得到1株新的mAbCR3022，可以中和逃逸CR3014的病毒，不与CR3014竞争结合重组S1片段。这2种非竞争性mAb通过识别受体结合结构域不同表位以协同作用的方式中和SARS-CoV，可以控制免疫逃逸并扩大抗体的保护范围，[24]同时这种协同作用也可以降低抗体的使用剂量。2.4.2核糖体展示技术目前抗体库技术还受两方面的因素影响:从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高;受外源基因转化率的限制，抗体库的库容不足以涵盖某种动物的抗体多样性。大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键。核糖体展示技术避开了上述不足，可制备大容量抗体库。该技术依赖于mRNA，核糖体和抗体蛋白(或多78 综述肽)通过非共价结合形成三联复合体，在无细胞体系中完成转录和翻译，实现基因型[25]和表型的偶联，翻译出来的抗体可用抗原进行筛选，由于不经过体内转化，构建的抗体库库容可达甚至超过1011。利用核糖体展示技术可以获得特异的、高亲和力的抗体。总之，抗体库技术从根本上改变了mAb的制备流程，成为众所瞩目的生物技术研究及开发热点之一。2.4.3转基因小鼠为了制备高亲和力的人源抗体，除了构建大容量抗体库外，还可以利用转基因鼠的方法。该方法首先利用基因敲除技术，将小鼠内源性免疫球蛋白(immunoglobin,Ig)基因敲除，然后向小鼠胚胎干细胞中导入人Ig基因座，获得含人Ig纯合小鼠后，利用鼠体内同种型转换和亲和力成熟的天然机制，通过小鼠体液免疫系统产生完全人源的[26]高亲和力抗体。转基因小鼠技术用于制备全人抗体时，具有功效高、靶亲和力强的优点。但也存在一些缺陷，转基因通常有体细胞突变和其他独特的序列，导致生产的抗体具有不完全是人序列，此外，由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的mAb具有鼠糖基化模式。[27]Sloan等利用携带人Ig基因的转基因小鼠获得了人源抗狂犬病毒mAb17C7，17C7识别狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号位点上的构象表位并能保护仓鼠完全抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击。治疗性抗体的上述4个发展阶段使鼠源性蛋白成分分别从100%下降至33%，乃至0%，成为真正的人源性抗体。嵌合抗体在人体内的半衰期(t1/2)约为4～5[28]d，人源化抗体的t1/2约为3～24d，重组的人源抗体的t1/2为11～24d。人源化及全人抗体是目前mAb研究的热点，随着mAb人源化程度的提高、免疫原性的降低和抗原抗体亲和力的增强，人源mAb在疾病治疗方面的应用将会越来越广泛。但是，自身免疫性疾病的存在说明人体免疫系统能对自身蛋白产生免疫反应，是否人源化程度越高越好是值得我们思考的问题。2.5抗体“鸡尾酒”法在抗病毒治疗过程中遇到的最大的问题就是病毒的变异。例如在接受抗流感病毒[29]H5N1抗体治疗的小鼠肺脏中分离出流感病毒H5N1的突变株。在接受帕利珠单抗治疗的婴儿体内分离出RSV突变株，序列分析发现突变点在RSV的融合蛋白上，不能被[30]抗体中和，因此患儿仍有急性下呼吸道的感染。79 广州医科大学硕士学位论文针对上述问题，科学家们将两种以上针对不同保护性表位的抗体制成混合物用于感染模型，很大程度上减少了突变株的产生。抗体鸡尾酒法通过靶向2种以上中和表位的互补抗体清除由单一抗体产生的突变株，另一方面通过增加病毒表面的抗体效价，[31][29][32]增强抗体的中和作用。目前，已开发了针对H5N1流感病毒、SARS冠状病毒、[33][34][35]HCV、HBV和狂犬病毒感染的抗体“鸡尾酒”法。3存在的问题和展望病毒感染性疾病严重威胁人类健康和生命，已成为困扰医学界的一大难题，特别是某些病毒感染性疾病的增长速度相当快以及层出不穷的新病毒，严重影响着全人类的健康。随着分子生物学和免疫学的发展，越来越多的病原体致病机制将在分子水平得到进一步阐明。对于一些尚无有效预防及治疗手段的感染性疾病，抗体治疗可作为首选方案。在研发针对病毒感染的有效的治疗性抗体的过程中遇到的最大问题是病毒的异质性和易突变性。交叉反应性抗体能中和初次分离的多种病毒，但其亲和力较差。针对这些问题，可能的解决方案有mAb的联合使用、mAb与其他治疗药物的联合使用及根据病毒进入细胞过程中起重要作用的高度保守的病毒结构研制新的有效的mAb或抗体衍生物，这将成为以后抗病毒研究的主要关注点。我们相信随着抗体技术的发展，在未来会有更多的抗病毒抗体用于临床。参考文献[1]BerryJD,GaudetRG.Antibodiesininfectiousdiseases:polyclonals,monoclonalsandnichebiotechnology[J].NBiotechnol,2011,28(5):489-501.[2]BothL,BanyardAC,vanDolleweerdC,etal.Monoclonalantibodiesforprophylacticandtherapeuticuseagainstviralinfections[J].Vaccine,2013,31(12):1553-1559.[3]ReadingSA,DimmockNJ.Neutralizationofanimalvirusinfectivitybyantibody[J].ArchVirol,2007,152(6):1047-1059.[4]BurtonDR,MascolaJR.AntibodyresponsestoenvelopeglycoproteinsinHIV-1infection[J].NatImmunol,2015,16(6):571-576.[5]CortiD,LanzavecchiaA.Broadlyneutralizingantiviralantibodies[J].AnnuRevImmunol,2013,31:705-742.[6]HanT,MarascoWA.Structuralbasisofinfluenzavirusneutralization[J].AnnNYAcadSci,2011,1217:178-190.[7]EulerZ,AlterG.ExploringthepotentialofmonoclonalantibodytherapeuticsforHIV-1eradication[J].AIDSResHumRetroviruses,2015,31(1):13-24.80 综述[8]HessellAJ,HaigwoodNL.NeutralizingantibodiesandcontrolofHIV:movesandcountermoves[J].CurrHIV/AIDSRep,2012,9(1):64-72.[9]SuB,MoogC.WhichantibodyfunctionsareimportantforanHIVvaccine?[J/OL].FrontImmunol,2014,5:289.[10]NasserR,PelegrinM,MichaudHA,etal.Long-lastingprotectiveantiviralimmunityinducedbypassiveimmunotherapiesrequiresbothneutralizingandeffectorfunctionsoftheadministeredmonoclonalantibody[J].JVirol,2010,84(19):10169-10181.[11]MichaudHA,GomardT,GrosL,etal.Acrucialroleforinfected-cell/antibodyimmunecomplexesintheenhancementofendogenousantiviralimmunitybyshortpassiveimmunotherapy[J/OL].PLoSPathog,2010,6(6):e1000948.[12]PelegrinM,Naranjo-GomezM,PiechaczykM.Antiviralmonoclonalantibodies:Cantheybemorethansimpleneutralizingagents?[J].TrendsMicrobiol,2015,23(10):653-665.[13]SoaresMM,KingSW,ThorpePE.Targetinginside-outphosphatidylserineasatherapeuticstrategyforviraldiseases[J].NatMed,2008,14(12):1357-1362.[14]AhnJ,FlammSL.HepatitisCtherapy:otherplayersinthegame[J].ClinLiverDis,2011,15(3):641-656.[15]BollaniL,BaraldiE,ChiricoG,etal.Revisedrecommendationsconcerningpalivizumabprophylaxisforrespiratorysyncytialvirus(RSV)[J/OL].ItalJPediatr,2015,41(1):97.[16]PaceC,MarkowitzM,MonoclonalantibodiestohostcellularreceptorsforthetreatmentandpreventionofHIV-1infection[J].CurrOpinHIVAIDS,2015,10(3):144-150.[17]JacobsonJM,KuritzkesDR,GodofskyE,etal.Safety，pharmacokinetics，andantiretroviralactivityofmultipledosesofibalizumab(formerlyTNX-355),ananti-CD4monoclonalantibody,inhumanimmunodeficiencyvirustype1-infectedadults[J].AntimicrobAgentsChemother,2009,53(2):450-457.[18]TaiwoB,MurphyRL,KatlamaC.Novelantiretroviralcombinationsintreatment-experiencedpatientswithHIVinfection:rationaleandresults[J].Drugs,2010,70(13):1629-1642.[19]GongR,ChenW,DimitrovDS.Candidateantibody-basedtherapeuticsagainstHIV-1[J].BioDrugs,2012,26(3):143-162.[20]BazanJ,CalkosińskiI,GamianA.Phagedisplay-apowerfultechniqueforimmunotherapy:1.Introductionandpotentialoftherapeuticapplications[J].HumVaccinImmunother,2012,8(12):1817-1828.[21]HammersCM,StanleyJR.Antibodyphagedisplay:techniqueandapplications[J/OL].JInvestDermatol,2014,134(2):e17.[22]VandenBrinkEN,TerMeulenJ,CoxF,etal.Molecularandbiologicalcharacterizationofhumanmonoclonalantibodiesbindingtothespikeandnucleocapsidproteinsofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus[J].JVirol,2005,79(3):1635-1644.[23]TerMeulenJ,VandenBrinkEN,PoonLL,etal.HumanmonoclonalantibodycombinationagainstSARScoronavirus:synergyandcoverageofescapemutants[J/OL].PLoSMed,2006,3(7):81 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攻读研究生学位期间发表的论文攻读研究生学位期间发表的论文(1)曾志奇,刘文宽,陈德晖,等.广州地区儿童呼吸道合胞病毒与肺炎支原体流行病学分析[J].中华实用儿科临床杂志,2015,30(22):1701-1704.(2)人3型腺病毒的中和性人源化单克隆抗体及其应用，专利号：201710302038.8.发明人：曾志奇，周荣，李小锋，李晨阳，刘铭龙。专利人：广州医科大学附属第一医院，广州呼吸疾病研究所，广东和信健康科技有限公司。(3)LiaoX,HuZ,LiuW,LuY,ChenD,ChenM,QiuS,ZengZ,etal.NewEpidemiologicalandClinicalSignaturesof18PathogensfromRespiratoryTractInfectionsBasedona5-YearStudy[J].PLoSOne,2015,10(9):e138684.(4)LiuW,ChenD,TanW,XuD,QiuS,ZengZ,etal.EpidemiologyandClinicalPresentationsofRespiratorySyncytialVirusSubgroupsAandBDetectedwithMultiplexReal-TimePCR[J].PLoSOne,2016,11(10):e165108.83 广州医科大学硕士学位论文致谢3年时间瞬间而过。多少实验失败的沮丧与失落，多少成功的喜悦与欢乐，都值得我去慢慢回味。感谢母校广州医科大学。在这里我度过了人生美好的7年学习时光，是广州医科大学为我提供了良好的学习、生活环境，解决了我的后顾之忧，使我不必在课题之外还要为自己的生计而奔波。衷心感谢导师周荣研究员，与导师的每次课题讨论都让我特别感动和振奋。导师的那种大度、自信、执着与精益求精永远是我学习的榜样；导师敏捷的思维、宽广的知识面及对课题严谨周密的分析屡屡让我叹服。拜于门下，倍感荣幸；聆听教诲，受益一生。衷心感谢李小锋教授，李小锋教授对学生的诲人不倦、对工作的严谨细致及对生活的满腔热情时时感染着我们，同时也为我们提供了一个既严肃又宽松的科研环境。在此要特别感谢李教授对我的信任与培养，每每想到李教授对我的夸奖与包容都让我感动和惭愧。感谢呼吸疾病研究所的刘文宽师兄、田新贵师兄、李潇师姐、林正诗老师在课题中给予的指导和帮助，同时感谢周志超师兄、刘甜恬师姐、刘振卫师兄、廖小红师姐、樊晔师姐、梁焕喜师姐的关心与支持。感谢广东和信健康有限公司崔红老师、刘铭龙师兄、商兴芳师姐在实验上给予的指导和关心。感谢广州锐达生物科技有限公司李晨阳老师、李园枚师姐、刘晓霞师姐、陈欣师姐、邓国亮、杨伟民等给予的指导和帮助。感谢同窗好友刘冬兰，黄文波等同学在课题中给予的帮助。感谢所有关心和支持我的其他老师和同学。也要感谢自己，为了今天，自己的3年坚持与汗水值得！感谢我的家人，不管成功与失败，他们总是默默的支持。最后要感谢各位专家和评委在百忙之中评审本文并给予指导！84 学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。文中依法引用他人的成果、对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：1．交回学校授予的学位证书；2．学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；3．本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。4．本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：日期：年月日学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属广州医科大学及附属单位。广州医科大学及附属单位享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广州医科大学及附属单位。任何其他收存和保管本论文的单位和个人，未经本论文作者、导师授权，不得将本论文转借他人、复制、抄录或以其他任何方式传播，否则，引起有碍作者的著作权益问题，将会追究相应的法律责任。论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日学位论文使用授权声明1、学校可以保留本论文的原件及复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存、汇编学位论文；2、本人授权学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。送交学位论文时间选择（请在下面相应栏内打“√”）：①答辩后即可送：是否②延迟一年后送：③延迟二年后送：④延迟三年后送：论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日85