壳聚糖 - 明胶复合不同软骨细胞体外构建组织工程软骨的实验研究

《壳聚糖 - 明胶复合不同软骨细胞体外构建组织工程软骨的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、壳聚糖/明胶复合不同软骨细胞体外构建组织工程软骨的实验研究1材料与方法1.1实验动物及主要试剂、仪器清洁级成年SD大鼠6只，雌雄不限，体重120～130g，由西安交通大学动物实验中心提供。壳聚糖/明胶（天津中医药大学中医药研究院）；胰蛋白酶、Trizol（GIBCO公司，美国）；透明质酸酶、Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）；RNA提取试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）；RNA逆转录试剂盒（MBI公司，美国）；慢病毒载体试剂盒（上海康成生物公司）；293T细胞（第四军医大学生物化学实验室）。1.2慢病毒

2、载体的构建和病毒获得参照我们既往方法及载体构建说明书，采用载体制粒扩增、重组，筛选最佳干扰序列。培养293T细胞，将含2μg目的基因的慢病毒表达载体与10μg包装质粒混合物混合，使用LipofectamineTM2000稀释后将混合物加入293T细胞培养皿中，37℃培养过夜。培养24h和48h后，分别收集24、36、48和60h的上清液。离心后转染软骨细胞，采用流失细胞仪检测荧光标记的细胞后，计算出病毒滴度为1.5106TU/mL。1.3软骨细胞的分离培养取SD大鼠颈椎脱臼法处死，浸泡于75

3、%乙醇中消毒30min。无菌操作台中取肋软骨组织，剥离软骨膜后放入10mL螺口瓶中，用眼科剪剪至大小约1mm1mm1mm的组织块；用10mL0.05%透明质酸酶室温下消化20min；弃酶液，D-Hank液洗涤后，将软骨小粒转入离心管内，加入5mL0.2%胰蛋白酶，于37℃磁力搅拌下消化30min；吸弃酶液，加入5mL0.2%胶原酶，于37℃振荡消化过夜；吸出含细胞的酶液，200目筛网过滤消化后的细胞悬液，所得细胞沉淀重悬于含10%FBS的DMEM培养基中。24h后更换培养液，以后每2天换液1次。细胞融合

4、达80%时以0.25%胰蛋白酶消化传代，采用甲苯胺蓝染色鉴定，取第1代肋软骨细胞用于实验。1.4病毒颗粒转染软骨细胞软骨细胞消化计数后以2104个/cm2密度接种于12孔板中，每孔8105个细胞，共8孔。将实验分为空白阴性对照组（对照组）及慢病毒转染组（实验组），每组各4孔。24h后去除培养液，对照组每孔加入细胞培养液0.5mL，实验组每孔加入0.5mL病毒液Aggrecanase-1、2后加入终浓度为8μg/mL聚凝胺。次日以细胞培养液换液，感染后48h加入终浓度为600μg/mL的G41

5、8抗生素进行筛选。1.5组织工程软骨的构建无菌条件下，取辐照灭菌的壳聚糖/明胶制作成3mm3mm3mm大小，置于24孔细胞培养板中。常规消化两组软骨细胞，调整细胞悬液浓度为1107个/mL，将50μL细胞悬液加入壳聚糖/明胶材料中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，以使软骨细胞附着于材料和培养板。小心加入2mL含20%FBS的H-DMEM培养液，注意勿冲洗材料，避免细胞流失。每天半量换液，共培养8周。1.6观测指标1.6.1扫描电镜观察于培养2、4周取出两组组织块，5%戊二醛固定，扫描电镜观

6、察支架材料表面软骨细胞黏附以及软骨细胞形态变化，观察细胞分泌情况。1.6.2组织学观察于培养2、4、8周取出两组组织块，常规石蜡包埋、切片，片厚5μm，行HE、Masson染色。1.6.3RT-PCR检测Aggrecanase-1、2及AggrecanmRNA含量于培养4、8周时用Trizol常规提取两组组织块RNA，RT-PCR检测Aggrecanase-1、2以及AggrecanmRNA含量。具体操作：将RNA逆转录为cDNA，总体积为20μL。取3μLcDNA进行PCR反应，反应

7、体系25μL，包括上游引物1μL、下游引物1μL、PCRMix（dNTP、PCRBuffer、稳定剂、DNA聚合酶）12.5μL、ddH2O7.5μL；各引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列、产物大小及退火温度见表1。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描分析目的基因灰度值，以β-actin为参照，计算相对吸光度（A）值，公式为：目的基因灰度值/β-actin基因灰度值。1.7统计学方法采用SPSS统计软件包进行分析。数据以均数&plusm

8、n;标准差表示，组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。2结果2.1软骨细胞形态学观察及鉴定每只大鼠可以分离得到（0.8～1.5）106个软骨细胞，展开后细胞呈多角形或圆形，6d左右融合，呈铺路石状，同时还有大量保持圆形的细胞。原代培养5d的软骨细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性，提示分离培养的细胞为软骨细胞。2.2扫描电镜观察培养2周时，对照组软骨细胞呈多角形，细胞开始伸展，细胞周边有大量细丝状分泌物；实验组细胞呈长梭形，有细胞突起，