人参二醇组皂苷对人胶质瘤u251细胞增殖与凋亡的

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1、人参二醇组皂苷对人胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的【摘要】  目的观察人参二醇组皂苷(PDS)体外对U251细胞增殖及凋亡的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度PDS对U251细胞增殖活力的影响;吖啶橙染色观察PDS诱导细胞凋亡情况;流式细胞仪分析细胞周期并计算细胞平均凋亡率;免疫细胞化学技术观察细胞内半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)9的表达。结果经中(100mg/L)、高(200mg/L)剂量的PDS处理后,U251细胞生长受到不同程度抑制,且呈现剂量依赖性;吖啶橙荧光染色可见经中、高

2、剂量PDS处理后的细胞呈现凋亡形态,并随药物剂量增加凋亡细胞数增多;流式细胞术结果显示,PDS可明显提高细胞的凋亡率,呈剂量依赖关系;免疫细胞化学染色结果表明,随着PDS剂量增加,细胞内激活的caspase9的表达上调。结论PDS体外对U251细胞增殖具有明显的抑制作用,其机制可能与诱导细胞凋亡有关。【关键词】细胞凋亡;人参二醇皂苷;细胞周期  人参为五加科多年生草本植物,其成分具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用〔1〕。人参皂苷是人参中主要的有效成分,迄今已确定结构的至少在30种以上,人参二醇组皂苷

3、(PDS)即是其中一种,具有抗缺血再灌注损伤、清除氧自由基、抗氧化、阻滞钙通道等多种生物学效应〔2,3〕。本研究通过观察PDS体外对U251细胞增殖及凋亡的影响,探讨其抗肿瘤机制。  1材料与方法  1.1试剂  PDS由吉林大学药学院天然药物分析实验室提取;四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品;激活的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)9多克隆抗体购于Takara公司,顺铂为山东齐鲁制药厂生产。  1.2细胞系及培养条件  人胶质瘤细胞株U251(中科院上海细胞生物化学研究所提供)培养在含10%

4、胎牛血清的RPMI1640培养液中,置37℃、5%CO2湿化的培养箱中,待细胞长满80%培养瓶时,分组加药。  1.3实验方法  1.3.1实验分组  RPMI1640空白对照组(A组);2μmol/L顺铂组(阳性对照组,B组);PDS低剂量(50mg/L)组(C组)、中剂量(100mg/L)组(D组)、高剂量(200mg/L)组(E组)。  1.3.2细胞形态观察  取对数生长期细胞,调整细胞密度为1×105接种于24孔板,1ml/孔。培养过夜后换新鲜的培养液,按前述分组加药,48h后倒置显微镜下观察细胞形

5、态。  1.3.3MTT比色法  在96孔培养板,接种细胞1×105/孔,每组4孔,加药孵育20h及44h后每孔加MTT(5g/L)20μl,继续孵育4h吸弃培养液,每孔加入DMSO100μl,震荡10min,用酶标仪(波长570nm)测定各孔吸光度值(A),计算细胞生长抑制率,抑制率≥30%为细胞对该药敏感。抑制率=(对照组A值-给药组A值)/对照组A值×100%。  1.3.4吖啶橙染色  将10mg吖啶橙溶于100ml、pH值为6.8的PBS中,过滤后4℃避光保存。细胞爬片经不同药物处理后,加入20μl

6、吖啶橙储存液,荧光显微镜下观察,拍照。  1.3.5流式细胞仪检测  传代培养的U251细胞接种于培养瓶中(1×106/瓶),次日加药处理,48h后收集细胞,冷PBS洗2次,-20℃、70%的冷乙醇固定,加入115mlPI(50mg/L)染色。混匀后上流式细胞仪做单参数分析,用累积曲线分割法计算各期细胞比例。  1.3.6免疫细胞化学染色  将大小适合的盖玻片放入6孔培养板中,接种细胞为5×105/孔,37℃、5%CO2中培养,次日加药,继续培养48h,PBS清洗,4%多聚甲醛固定,免疫细胞化学技术观察细胞内

7、激活的caspase9表达情况。  1.4统计学处理  数据处理采用SPSS9.0统计软件,数据以x±s表示,组间比较采用χ2检验。  2结果  2.1PDS对U251细胞生长的影响  2.1.1细胞形态观察  A组细胞贴壁能力强,细胞生长旺盛,形态完好。经PDS处理48h后,D、E组细胞形态均发生明显改变,即细胞呈现类圆形,周缘毛糙不规则,胞质中颗粒较多,贴壁能力下降,且出现悬浮细胞和细胞碎片,以E组较为突出,48h后C组也可见少许死亡细胞出现。表明中,高剂量PDS体外可以抑制U251细胞生长。见图1。  

8、2.1.2不同药物对U251细胞增殖抑制作用  随着PDS浓度增加和作用时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐增高,且呈明显时间、剂量依赖性。见表1。表1不同时间PDS对U251细胞的增殖抑制率(略)  2.2细胞凋亡检测  2.2.1吖啶橙染色  A组细胞呈均匀绿色,形态规则,未见凋亡细胞;D、E组细胞出现不规则橘黄色荧光,细胞体积变小,胞核皱缩,呈现凋亡细胞的形态改变,且个别细胞胞膜破裂。见图2。  2

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