枸杞rapd反应体系的建立与优化

《枸杞rapd反应体系的建立与优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、枸杞RAPD反应体系的建立与优化作者：严奉坤，许兴，殷敏，杨亚亚，王娜【摘要】目的探索枸杞RAPD反应体系并对其进行优化。方法在本实验室常用的RAPD反应体系的基础上，根据RAPD扩增效果确定枸杞基因组DNA的最佳RAPD反应体系。结果建立了适合枸杞的RAPD反应体系：20μl体系中含1×PCRbuffer，50ng模板，0.4μM10碱基随机引物、1UTaqDNA聚合酶、2mMMg2+，125μMdNTPs。结论枸杞的RAPD反应体系能够用于枸杞的RAPD分析。.L.编辑。【关键词】枸杞；RAPD；反应体系　　EstablishmentandOptimizationofRAPDReac

2、tionSysteminLyciumbarbarum　　Abstract：ObjectiveTostudytheRAPDreactionsysteminLyciumbarbarumL.andoptimizationofit.MethodsBasedontheRAPDreactionsystemsuitableforLyciumbarbarumL.plificationcontaining1×PCRbuffer,50ngtemplateDNA,0.4μmprimer,1UTaqDNApolymerase,2mmol/LMg2+,125μmol/LdNTPs.ConclusionTheRAP

3、DreactionsystemcanbeusedtoRAPDanalysisinLyciumbarbarum.　　Keybarbarum；RAPD；Reactionsystem　　RAPD由PeltierThermalCycler，MJResearch，Inc，USA）；电泳仪（DYY-10C型；北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCp-31型；北京六一仪器厂）；SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪（BIO-RADLab，Inc，USA）；Eppendorf5415D离心机；UVPGDS-8000凝胶成像系统。　　Buffer、TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、300bpDN

4、Aladder购自北京天为时代公司，10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司，Agarose（Promega公司），EB（瑞士FlukaChemika公司）。　　1.3方法　　1.3.1枸杞基因组DNA提取枸杞基因组DNA提取根据严奉坤等［3］的提取法进行。　　1.3.2PCR扩增及电泳检测反应在PTC-200型PCR仪上进行。初始扩增条件采用本实验室长期使用的20μl反应体系，其成分为：10×Buffer（不含Mg2+）加0.8μl25mmol/LMg2+，1μl2.5mmol/LdNTPs，1UTaqDNA聚合酶，1μl0.375μmol/L10碱基随机引物，50ng模板。反应程

5、序：预变性94℃2min；预扩增程序：94℃20s，36℃30s，72℃1min，5个循环；扩增程序：94℃20s，40℃30s，72℃1min，40个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保存。扩增产物经含有0.5μg/mlEB的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（72v电压下电泳45min），电泳结束后在UVPGDS-8000凝胶成像系统上观察照相。　　2结果　　RAPD标记对PCR反应条件有较高的要求，因此在实验前需要建立严格稳定的反应体系，以确保准确、稳定地扩增。将模板DNA浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、Mg2＋浓度、dNTPs浓度、退火温度和循环次数按单因素试验方案进行扩增

6、实验，得到优化体系的结果。　　2.1DNA浓度在PCR反应体系体积为20μl，引物浓度0.375μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、Mg2＋浓度1.0mmol/L、dNTPs浓度125μmol/L条件下，设定模板梯度0.5，1，2，20，200，500，1000和2000ng/20μl，以确定适宜的模板浓度。结果见图1所示。从图1看出：每反应中模板的终浓度小于1ng/μl时无扩增；在模板终浓度为1～10ng/μl的范围内有最佳的扩增,RAPD带的式样完全重复；而超出此浓度范围如在25ng/μl时扩增式样改变并丢失大部分带，在50ng/μl和100ng/μl时扩增产物一片弥散。　　2.2

7、引物浓度在PCR反应体系体积为20μl，模板浓度50ng/20μl、TaqDNA聚合酶1U、Mg2＋浓度1.0mmol/L、dNTPs浓度125μmol/L条件下，设定随机引物浓度0.1，0.2，0.4和0.5μmol/L，以确定适宜的引物浓度。结果见图2所示。从图2看出：引物浓度0.4μmol/L时，扩增出的带型清晰、完整且背景较浅。相比之下，过高和过低都不能真实地反映扩增结果，引物浓度过高（如0.5μmol/L）使得扩增的条带数