宁夏枸杞ISSR-PCR反应体系的建立与优化

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1、江苏农业科学2011年第39卷第5期一41一思彬彬，赵海燕，热汗姑·阿布都．宁夏枸杞ISSR—PCR反应体系的建立-9优化[J]．江苏农业科学，2011，39(5)：41—43宁夏枸杞ISSR—PCR反应体系的建立与优化思彬彬，赵海燕，热汗姑·阿布都(北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021)摘要：采用正交试验和单因子梯度优化相结合的方法，建立和优化枸杞稳定的ISSR—PCR的反应体系和扩增程序。结果表明，适用于枸杞的25IxLISSR—PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为：dNTPs0．

2、25mmol／L，Mg2．0mmol／L，引物0．4i~mol／L，模板DNA50ng，Taq酶1．0U。对于枸杞ISSR—PCR试验，一次正交试验完全可以建立满足要求的PCR体系。．关键词i枸杞；ISSR—PCR；正交设计；单因子中图分类号：$567．19文献标志码：A文章编号：1002—1302(2011)05—0041—03枸杞(LyciumbarbarumL．)属茄科多年生落叶灌木，是我应体系，除表中变化因素外，每管中还含有2．510×PCR国传统名贵中药材。近代医学研究表明，枸杞具有增强免疫B

3、ufer，引物选用813，PCR扩增程序为：94℃预变性5rain；力、防衰老、抗肿瘤、抗氧化等多方面的药理作用⋯。枸杞主94℃变性45S，退火9OS，72℃延伸90S，41个循环；72oC延要分布在宁夏、内蒙古等地的干旱和半干旱地区，虽然枸杞在伸7rain，4oC保存。扩增反应结束后，PCR产物在1．2％琼脂国内已被许多省区引种，但是成品枸杞仍以宁夏枸杞最为道糖凝胶上电泳，凝胶中含0．05％的溴化乙锭，电极缓冲液为1地，其果实被誉为“红宝”而驰名中外。×TAE，电压5V／cm电泳结束后在凝胶成像分析仪

4、上观测分iSSR(inter—simplesequencerepeat)分子标记是Zietk—析并照相。iewicz等于1994年创建，是基于微卫星技术发展起来的一表1宁夏枸杞ISSR—PCR反应体系L16(4)正交试验因素水平种新型分子标记技术，具有多态性高、稳定性好、产物特异性强等特点，目前被广泛应用于植物的品种鉴定、基因定位、遗传作图、分类与进化等诸多领域。运用ISSR标记技术时，不同的反应体系可产生不同的结果，为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性，进行ISSR—PCR反应体系的优化非常必要。

5、本研究采用正交和单因素相结合试验设计，建立枸杞ISSR—PCR最佳反应体系，旨在为今后枸杞遗传多样性、亲缘关系、种源鉴定、优良性状标记等研究奠定基础。1材料与方法1．1材料与仪器试验所用材料为宁杞I号，采自北方民族大学试验基地。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列，由上海生物工程公司合成。PCR反应相关试剂购自大连宝生物工程有限公司，PCR反应在GeneAmpPCRsystem9700PCR仪上进行。1．2方法1．2．1基因组DNA的提取以枸杞叶片为材料，采用改良CTAB法提取。用1．

6、O％琼脂糖电泳和核酸检测仪检测DNA质量浓度，并稀释至50ng／’，一20℃保存。1．2．3ISSR—PCR反应体系单因子试验依据正交试验结1．2．2ISSR—PCR反应体系正交试验设计采用L(4)正果，选择扩增效果较好的反应体系，在此基础上进行单因素试交试验设计，对dNTPs、Mg“、引物、模板DNA和Taq酶进行5验，进一步优化影响扩增效果的因素。其中dNTPs浓度设置因素4水平筛选(表1)。根据表．1制备总体积为25的反0．10、0．15、0．20、0．25、0．30、0．35mmol／L6个梯度

7、，Mg2浓度设置1．4、1．6、1．8、2．0、2．2、2．4mmol／L6个梯度，引物浓收稿日期：2010—11—19度设置0．30、0．35、0．40、0．45、0．50、0．55txmol／L6个梯度，基金项目：北方民族大学资助项目(编号：2007Y049)DNA模板设置10、20、30、40、50、6O、80、100、12Ong9个梯度，作者简介：思彬彬(1977一)，硕士，讲师，研究方向：分子植物病理学。raq酶用量设置0．50、0．75、1．00、1．25、1．50、2．00U6个Tel：(

8、0951)2067893；E—mail：sibinbinl15@163．c0m。梯度。彬彬，等：宁夏枸杞ISSR—PCR反应体系的建立与优化正交设计可以更快更有效地分析不同因素的互相作用，但处理水平的设置相对有限。单因素设计可以较系统和精细地研究各主要因子的影响，但无法探讨因素间的互作效应。本试验首先采用正交设计筛选出可扩增出条带的PCR反应体系，然后结合单因子设计进一步优化体系，弥补上述试验不足，简单快速地建立枸杞ISSR—PCR反应体系