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1、第32卷第4期中国草地学报2010年7月Vol32No4ChineseJournalofGrasslandJul2010文章编号:1673-5021(2010)04-0080-06燕麦ISSR反应体系的建立与优化121,*1刘欢,慕平,赵桂琴,孙丽坤(1.甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州730070;2.甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070)摘要:以10个燕麦品种的基因组DNA为模板,从退火温度、TaqDN
2、A聚合酶、Mg2+、dNTP、引物5个方面对ISSR分子标记体系进行摸索并设计优化试验,建立了一套燕麦ISSR优化反应体系,即:25l反应体系中,183lddH2+2O,2.5l10buffer,2.0mol/LMg,250mol/LdNTP,1.5UTaqDNA聚合酶,0.3mol/L引物,10ngDNA模板。反应程序为:94预变性3min;94变性30s,55退火30s,72延伸1min,34个循环;72延伸5min,4保存。关键词:燕麦;ISSR分子标记;反应体系;优化中图分类号:S5437
3、文献标识码:A燕麦(Avenasativa)是禾本科燕麦属一年生草1材料与方法本植物,主要分布在北半球的温带地区,以俄罗斯、美国、加拿大、德国、澳大利亚、中国、芬兰等国家居1.1试验材料多。燕麦籽实中含有丰富的水溶性膳食纤维、矿物供试的10份燕麦材料(表1),均由甘肃农业大元素、多种维生素和氨基酸,具有很高的营养价值;学草业学院提供。随着人们对健康食品的日益重视,食用燕麦产品也表1试验材料及其来源越来越多,一些国家还将其用于开发保健品和化妆Table1Materalsandtheirsource品。此外,燕麦叶片
4、多汁、秸秆柔嫩、适口性好,具有代号品种来源CodeVarietySource较高的饲用价值;在我国青藏高原及其周边的高寒1青引1号青海地区,燕麦是家畜的主要饲料,对其深入研究对畜牧2青引2号青海34628加拿大业发展和生态建设具有重要意义。4Calibre加拿大简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)是一种5初岛日本基于PCR的分子标记技术。ISSR标记为随机引6CNC加拿大7Blackbutt澳大利亚物,该技术具有操作简单、成本低、快速灵敏、多态性8巴燕3号青海高、所需DNA量少以及无需预知研究对象的基因9黄燕麦甘肃组序列等优点
5、,同时也具有SSR的稳定性,近年来10丹麦444丹麦已迅速应用于品种鉴定、遗传作图、种质资源遗传多[1~2]1.2ISSR引物信息样性等领域的研究。对于燕麦,国外的研究侧ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提重于目的基因的分离、分子连锁图谱构建和基因定供的ISSR引物序列,由上海生物工程有限公司合[3~4]位等方面,我国在良种繁育、栽培技术、加工生成。产方面的研究居多,目前国内有研究利用同功酶及1.3植物基因组DNA提取与检测RAPD、AFLP对燕麦品种间的遗传差异进行分[8]采用CTAB法提取燕麦基因组DNA。用[
6、5~7]析,但利用ISSR标记研究燕麦遗传多样性尚08%琼脂糖凝胶电泳检测DNA,并用紫外分光光未见报道。本研究对燕麦ISSR分子标记反应体系2+*通讯作者,E-mail:zhaog07@yahoo.com中5个因素(退火温度、Taq酶、Mg、dNTP和引收稿日期:2010-01-18;修回日期:2010-03-29物)在4个水平上进行试验,旨在建立燕麦ISSR分基金项目:农业行业科研专项(nyhyzx07009-06);国家科技支撑子标记的最佳反应体系,为进一步探讨燕麦品种间计划(2008BADB3B07)资助的遗传多样性、
7、遗传图谱构建和基因定位奠定基作者简介:刘欢(1982-),女,山东招远人,硕士,主要从事牧草生础。物技术方面的教学和研究工作,E-mail:liuhuaner@yahoo.com.cn.80刘欢慕平赵桂琴孙丽坤燕麦ISSR反应体系的建立与优化度计测定OD值和浓度。最后将样品稀释为10ng/L,-20保存备用。1.4ISSR反应体系的初步建立2+试验从退火温度、TaqDNA聚合酶、Mg、dNTP、引物浓度五个方面进行筛选和优化。根据文[9]献和试验要求对DNA扩增中的一些参数进行梯度设置,并严格控制其它参数
8、和反应条件,确保试验麦品种的DNA电泳检测,顺序如表1。的准确性、可比性。根据加拿大哥伦比亚大学公布M-Marker;1to10representtheresultsofelectrophoresis[10]的96个ISSR引物,分别在小麦(Triticumae
