利用大孔吸附树脂从葛根中分离与纯化大豆苷

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1、利用大孔吸附树脂从葛根中分离与纯化大豆苷【摘要】目的从葛根中获取高强度的大豆苷样品。方法用大孔吸附树脂进行分离，反复结晶进一步纯化。结果D101树脂适宜于大豆苷分离，30%乙醇洗脱液放置析出白色沉淀，以甲醇结晶2～3次，得针状晶体，该晶体HPLC测定大豆苷。结论该方法操作简单易行，成本低，分离大豆苷纯度高，安全性能好。纯度92.4%，收得率为3%。【关键词】大孔吸附树脂；葛根；大豆苷；高效液相色谱；分离纯化葛根为豆科植物野葛Puerarialobata(l(HPLC测其浓度为C1)，在振荡器上振荡24h，频率为120次/min，成分吸附后，过滤，HPLC测定剩余溶液中大豆苷的浓度C2

2、，按下式计算各树脂在室温时的吸附量Q(mg大豆苷/g干树脂)。　　Q=(C1-C2)V/g/g)；C1，C2—吸附前后大豆苷溶液的浓度(mg/ml)；V为黄酮溶液的体积(ml)；l，浸泡后振荡24h，过滤后，测定滤液中大豆苷的浓度，根据解吸量计算出解吸率(%)。　　解吸率(%)=［解吸量/吸附量］×100%　　2.5大豆苷梯度洗脱实验称取葛根异黄酮粗品20g。置于烧杯中，用200ml的热水溶解，趁热过滤(如果过滤速度慢，可以采用抽滤的方式)。待滤液冷却后上D101树脂(44cm×4.5cm)，依次用1000ml的水、1500ml的10%的乙醇、1000ml的30%的乙醇洗脱。在30%

3、的乙醇洗脱过程中，每100ml接一瓶，同时用HPLC测定每瓶中大豆苷的含量，然后以HPLC的大豆苷的积分值对洗脱瓶序号做出洗脱曲线。　　采用上述实验方法，仅把30%的乙醇改为25%的乙醇洗脱，做出洗脱曲线。　　比较30%和25%乙醇洗脱曲线的异同。　　2.6大豆苷制备实验实验方法同“2.5”项。30%的乙醇洗脱液每100ml接一瓶，放置数天，观察溶液的变化。　　2.7大豆苷结晶实验30%乙醇洗脱液放置析出白色不溶物，HPLC测定大豆苷含量越高的洗脱瓶析出白色不溶物越多，对白色不溶物进行结晶［8］。不溶物过滤烘干后置于烧杯中，然后滴加甲醇，用水浴或加水促溶使其溶解，过滤，放置结晶。　　

4、3结果　　3.1大豆苷饱和吸附量的测定结果见表1。表1不同树脂条件下大豆苷的饱和吸附量（略）　　从表1可以看出，5种树脂的的饱和吸附量都较小，大约在30mg大豆苷/g干树脂，不同树脂对大豆苷的吸附能力为：D101>AB-8>D130>D3520>NKA-9，弱极性的D101、AB-8、D130大孔吸附树脂对大豆苷有较好的吸附能力，适宜于大豆苷的分离纯化。　　3.2大豆苷解吸率实验结果见表2。表2各种饱和吸附树脂在不同乙醇浓度下的解吸率（略）　　结果表明，解吸剂的极性越小，解吸率越高的趋势。D101、AB-8对不同的解吸剂都可以获得50%以上的解吸率。　　3.3

5、大豆苷梯度洗脱实验在制备葛根素的实验中发现，通过加大乙醇的浓度，可以分离得到大豆苷。但是由于样品溶液中葛根素的含量较高，相反大豆苷的含量却很小。因此分离大豆苷时，必须先去除大部分的葛根素，才能达到富集大豆苷的目的。　　一般的，10%的乙醇对分离葛根素效果是最好的，通过加大10%的乙醇的洗脱量(1500ml)，可以把大部分葛根素先洗下来。然后用30%或25%的乙醇洗脱。结果见图1。　　在30%的乙醇洗脱液中仍有较多的葛根素存在，并且在葛根素后面有较大的峰，说明还有含量较高的杂质影响大豆苷的纯化。由于二者保留时间相差较长，作了第2次实验，用15%的乙醇洗脱葛根素，用25%的乙醇洗脱大豆苷

6、。结果见图2。　　通过比较两图可以看出，用30%的乙醇洗脱，大豆苷的洗脱量大，分离效果好，峰形尖锐，大豆苷集中出现第3瓶中，这样有利于大豆苷的分离纯化；相反的25%的乙醇洗脱时，洗脱曲线平缓，大豆苷的分布范围广，比较均匀的出现在洗脱过程中，不利于富集大豆苷。　　梯度洗脱时，可以首先用水洗去蛋白质、糖类等水溶性杂质，然后用过量10%的乙醇把大部分的葛根素洗去这样有利于大豆苷的富集，再用30%的洗脱大豆苷。　　3.4大豆苷结晶实验白色的不溶物用甲醇结晶，滤液放置2～3h有白色的针状晶体析出。晶形良好，甲醇用量大约是：沉淀物1g，甲醇用40ml。不溶物反复结晶1～2次。实验结果如表3。表3

7、不同溶剂对结晶纯度的影响（略）　　通过比较，过柱分离后的沉淀中含有较多的大豆苷，并且含量很高，用甲醇-水结晶后，纯度反而降低了，这说明甲醇-水不适合作结晶溶剂，直接用甲醇重结晶2次，大豆苷的纯度为92.3%。　　4讨论　　树脂分离所得的白色不溶物是30%的乙醇洗脱下来的，说明大豆苷在30%的乙醇中可以达到很高的纯度，因此，结晶的溶剂也可以采用乙醇或乙醇的水溶液。葛根素和大豆苷的极性相差较小，从分离的原理上讲，在同一颗柱子通过改变乙醇的极性可以把两种成分分离