重组腺病毒ad.vsg

《重组腺病毒ad.vsg》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、重组腺病毒Ad.VSG【摘要】目的探讨重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2对大鼠移植肝缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。方法重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2通过门静脉注入实验组供体大鼠肝脏，术后36h剖腹获取供肝，并将其保存在4℃乳酸钠林格液中4h，“双袖套法”行原位肝移植术。门静脉复流6h后观测受体胆汁分泌情况，处死受体大鼠，检测血浆中天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酸（LDH）水平，肝脏组织中Bcl-2和TNF-α表达，TUNEL法检测肝脏组织的细胞凋亡，电镜观察肝脏组织的亚细胞结构变化。结果术后6h，免疫组化和ethodsTh

2、edonorrat′sliverizedtoremovethegraftliver.Thegraftedusingthecufftechnique.Sixhoursafterthat,therelevantliverfunctionparametermunohistochemicalanalysisandunohistochemistryshoorphologychangesilderandtheapoptosisindexinisteredviatheportalvein,therebinantAd.VSG-hBCL-2canbeexpressedinratli

3、vers.Andinvivo,theoverexpressionofBcl-2canreducethesubsequentischemia/reperfusioninjuryinthegraftliver.Keyia/reperfusioninjury;genetransfer;Bcl-2;rat肝细胞凋亡是移植肝缺血/再灌注损伤的主要机制［1］。在器官移植前，将外源性凋亡抑制基因转染入移植物，并表达功能性蛋白，以抑制供肝的细胞凋亡，从而减轻手术后移植肝的缺血/再灌注损伤，对提高移植肝存活时间和改善肝功能等方面具有重要意义。我们以改良“双袖套法”建立大鼠原位肝移植

4、模型，应用重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2转染供体肝脏，观测Bcl-2在大鼠肝脏组织中的表达及其在大鼠原位移植肝缺血/再灌注损伤中的保护作用，为探索移植肝缺血/再灌注损伤的保护方法提供理论依据。1材料和方法1.1材料1.1.1主要试剂重组腺病毒Ad.VSG-hBCL-2（上海第二军医大学基因实验室），LipofectAmine2000试剂盒（GibcoBRL公司），鼠抗人HBCL-2单克隆抗体Stressgene：SPA810（人、鼠、兔共享），兔抗鼠TNF-α(SantaCruz公司)，免疫组化试剂盒(博士德公司)，TUNEL试剂盒（Roch公司），g/kg

5、）。②麻醉成功后上腹部正中切口入腹，将肠管推向左下腹，显露门静脉及肠系膜静脉。③细针穿刺肠系膜静脉，缓慢注射Ad.VSG-hBCL-2悬液（1.5×1012pfu/L）2ml，压迫止血1min后关腹。④麻醉清醒后1h，自由饮水、进食。B组：病毒空载体Ad-EGFP悬液（1.5×1012pfu/L）2ml预处理供体大鼠，方法同A组。C组：0.9％氯化钠溶液2ml预处理供体大鼠，方法同A组。1.2.3受体处理方法及标本采集A组：①Ad.VSG-hBCL-2预处理供体大鼠36h后获取供肝称重（g），以乳酸钠林格液灌注保存，冷缺血时间为4h。②采用“双袖套法”行原位肝移植

6、术［2］，受体门静脉复流6h后麻醉进腹，于胆总管内置入硬膜外麻醉用导管，根据导管中胆汁的长度推算每分钟的胆汁分泌量，再除以供肝的质量，即为每分钟每克肝脏的胆汁分泌量（μg·min-1·g-1）。硬膜外导管测量胆汁分泌量的方法：向胆总管近端插入硬膜外导管，测量每分钟胆汁引流的导管长度。导管体积测定：用微量注射器向导管内注入50μl有色液体测量其长度，共6次，计算得1mm=(0.65±0.26)μl。③从肝下下腔静脉抽血1.0ml，检测天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酸（LDH）。④切取肝左叶，置入液氮保存，备检age-ProPlus图像分析

7、软件，切片组织在400倍光学显微镜放大下，摄取图像并输入分析系统，选择并测量染色阳性面积与视野面积。每张切片随机选5个视野，将Bcl-2及TNF-α表达的阳性面积除以视野面积（％），取其均值为“阳性区域面积”。②凋亡指数：光镜下每例标本切片随机选取5个400倍视野，计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，以百分数表示为凋亡指数（apoptoticindex，AI）。1.3统计学处理数据以±s表示，采用SAS统计软件包进行方差分析及两两比较，检验水准:α＝0.05。2结果2.1胆汁分泌量门静脉复流6h后测定胆汁分泌量，A组与B组、C组相比较明显增加，差异有统计学意义

8、（P<