重组人cxcr1腺病毒的构建

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1、重庆医科大学硕士学位论文重组人CXCR1腺病毒的构建姓名：杨彦鹏申请学位级别：硕士专业：临床医学指导教师：施琼201205重组人cXCRl腺病毒的构建摘要CXCRl是只含有一条肽链的糖蛋白，为Q亚族趋化性细胞因子受体。cxcRl可与IL．8特异性结合，介导细胞信号转导的启动，通过信号传导过程，决定相应配体趋化功能的实现，与细胞的活化、增殖、迁徙及刺激血管形成和释放血管形成前体物质等有关，因此CXCRl涉及到多种疾病的发生发展。为进一步研究CXCRl在人体中各种疾病的发生发展中的作用，我们构建CXCRl基因腺病毒表达载体，使得C

2、XCRl基因在细胞内得以表达。目的：应用AdEasy腺病毒载体构建人cxcRl基因的重组腺病毒pAd-CXCRl。力怯：1．根据GellB诎己收录的CXcRlcDNA全长设计引物并送合成，采用PCR方法扩增CXCRl基因。2_每目的基因的扩增片段克隆至穿梭质粒pAdTrace，构建穿梭质粒pAdTrace—CXCRl，并用KpllI和HmmI双酶切进行鉴定。3．Pe斌酶切pAdTrace．CXCRl使之线性化，用电转化法将线性质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1转入BJ5183细菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒pAd—C

3、XCRl。4．重组腺病毒用酶切及PCR方法进行鉴定。5．重组腺病毒质粒用PacI线性化后转染砸K一293细胞，进行腺病毒的包装，并在ⅧK一293细胞中进行腺病毒扩增。结果：通过腺病毒构建系统及酶切、连接、转化等技术，成功的构建了穿梭质粒pAdTrace—CXCRl。将线性化的穿梭质粒质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy一1于BJ5l83细菌内进行同源重组，最终成功构建重组腺病毒质粒pAd．CXCRl。将pAd．CXcRl质粒于娅K．293细胞内扩增，得到高滴度人CXCRl基因的腺病毒载体。结论：成功构建了人cxcRl基因的腺病毒

4、载体，得到高滴度的腺病毒，为进一步研究CXCRl蛋白的生物功能及其在临床各种相关疾病中的作用奠定了基础。粼词：cxcRl；腺病毒；腺病毒重构；同源重组4．壁墅鉴型垄丝燮奎—_————————————————————————————————————————————————————————————一一CONSTRUCTIONOFTHERECoMBINANTAI'ENOⅥRUSVECToRENCoDINGCXCRlGENEABSTRACTCXCR1isoneofthemembersinchemokmereceptorfamily，i

5、tisaglycoproteinw11ichhasonlyonepeptidecham．HaVillgtheIL-8asitsmainligand，CXCRlcancombmationwi．thIL一8specialy．AReritbindhlgwithligands，CXCRlmediatechemotaxisViasigml仃ansductionwKchactiVethechemotacticf嘶ctionofthecorrespondingligalld．CXCRlirⅣolVesintheceUactivation，p

6、roliferation，migration，龇培iopoiesisandreleasingangiogemcprecurosors．ReserchhasfoundthatCXCRlisconnectedwiththepathogenesisofavarie够ofdiseasesrelatedtoinn黜ation，tumourandimmuneoreaction．WeconstmcttherecombinantadenoVirusoffusiongeneencodingCXCRl，whichcanmaketheCXCRleX

7、pressioni11humallcell·objective：110cons仃uctthereplication—deficientreconlbmantadenovims．CXCRlbyAdEasysystem．Method：1．Weobt出edthegeneencod吨ofCXCRl舶mGeneBankanda．nlplifiedbyPCR．2．TheCXCRlgenewasc010nedtothesn啦leplasmidpAdTrace．WbexcisedtheplasmidpAdTrace-CXCRlwi也KpllI

8、andHinmIItocofimtheplasmidwascorrectcons仃ucted．3．WedigestedtherecombinalltadenovimsplasmidspAdTrace-CXCRlwithPemI．Thelillearizedsh嘣leplasm