碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达-本科基因工程实验论文开题报告

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1、编号内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室本科基因工程实验论文开题报告论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达学生姓名：年级：专业：指导教师：年月日8学生姓名民族族性别出生年月论文题目碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达开题时间年月日结题时间年月日项目来源本科生基因工程大实验课一、立论依据项目的研究意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)是一种非特异性磷酸单酯酶，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖，

2、也能催化磷酸基团的转移反应。AP广泛存在于微生物和动物体内，在磷生物地球化学循环过程中有重要作用，并广泛应用于诊断学、生物化学及分子生物学等领域。1大肠杆菌碱性磷酸酶20世纪80年代相继完成了大肠杆菌AP、人胎盘型AP、人肝/骨/肾型AP、人小肠型AP和酿酒酵母AP氨基酸序列的测定，通过序列比较发现相似性为25%~30%，活性部位高度保守，都保留了Ser102残基、Arg166及金属离子配体，这些保守的与催化活性相关的基团暗示了不同来源的AP具有相似的作用机制。另外，功能相似的磷酸二酯酶，如蜡状芽孢杆菌中的磷脂酶C、桔青霉中核

3、酸酶P1，它们的活性部位和金属离子结合位点与大肠杆菌AP相似。所以，大肠杆菌AP还可作为其它磷酸酯酶和以金属离子作辅助因子的磷酸酯酶的研究模型。AP确切的生理功能还不十分清楚，但认为它对有机体内磷代谢的调节有重要作用。大肠杆菌AP的结构基因是phoA，它是pho调节子的一部分，pho调节子主要调节磷的转运和代谢。Phobox是pho调节子所有基因启动子区域的共有序列，受PhoB蛋白的调控。phoB基因产物直接激活pho调节子的转录，而PhoB蛋白又被PhoR蛋白磷酸化激活。细胞外磷的水平是调控PhoR的信号，信号传递通过大肠杆

4、菌Pst系统实现。当接收到环境信号后，PhoR再去调节PhoB，而PhoB就是大肠杆菌AP结构基因phoA的直接转录调节者。当处于低磷状态时，PhoR使PhoB磷酸化，激活大肠杆菌AP结构基因phoA的转录；当处于高磷状态时，PhoR会使PhoB去磷酸化以阻止phoA大肠杆菌AP结构基因的转录。2哺乳动物碱性磷酸酶此外，哺乳动物碱性磷酸酶哺乳类AP和大肠杆菌AP基本三维结构框架非常相似，与催化活性相关的部位高度保守，2001年获得PLAP的X-射线晶体结构也证实了这一点8，所以哺乳类AP与大肠杆菌AP应具有相似的催化机制。但哺

5、乳类AP也有其特点，如哺乳类AP主要为膜结合蛋白，它们通过磷脂酰肌醇葡聚糖锚定在细胞膜外侧；另外，细菌AP是由单基因编码，而哺乳类AP则是多基因编码的，细菌的AP分子两个亚基完全相同，而哺乳类AP分子两个亚基可能不同。哺乳类AP确切的生物学功能和作用机制还不十分清楚。目前认为骨骼的矿化依赖于正常的AP的活动，对此观点最直接的证据可能是低磷酸酯酶症。低磷酸酯酶症是一种先天性代谢紊乱的骨疾病，为TNAP编码的结构基因发生突变，使血液中AP活力低于正常水平，表现为骨化及骨发育不全，至今已有200多种TNAP突变基因型被报道，虽然还无

6、法治愈，但最近间叶干细胞移植的成功为该病的治疗提供了新的途径。另外，在运输营养物质的组织中如小肠上皮刷状缘表面、胎盘合胞体滋养层表面、胆小管表面细胞膜上AP的含量很高，提示AP与磷酸的转移和代谢有关。总之，不同组织和器官的AP有不同的生理功能，但有一些仍然是未知的。3碱性磷酸酶的应用AP在医学和分子生物学等领域有广泛的用途。在临床医学上，测定血清中AP的活力已成为诊断和监测多种疾病重要手段。AP主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查，患这些疾病时，肝细胞过度制造AP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于

7、肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清AP明显升高。而血中肠型AP明显升高可见于各种肠道疾病，也有文献报道某些消化系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血中还可以出现免疫球蛋白复合物型AP，此种AP同工酶出现的机理尚未清楚。AP同工酶作为肿瘤组织的一个标志也逐渐为人们所认识，如肺脏、睾丸、卵巢、胰腺、结肠和淋巴组织等恶性肿瘤病人血清中含有PLAP。骨型AP作为骨代谢异常的标志物越来越受到临床重视；血清骨型AP活力的定量测定可作为监测骨形成变化的有效参数，在其他的骨代谢异常疾病(如骨软化症、佝偻病等)及早期甲状腺机能亢进的病人

8、、慢性肾衰病人、接受肾脏移植的病人血清中的骨型AP活性均有不同程度的改变，对骨型AP活性的检测及动态观察将为疾病的早期诊断、治疗效果的监测、病情预后等提供有效的依据。8在动物饲养和疾病诊断方面，AP是反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙、磷代谢的重要生化指标。钙、磷供应不足对动物