pparγ通路在舒林酸抑制胃癌细胞增殖中的作用及机制

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1、PPARγ通路在舒林酸抑制胃癌细胞增殖中的作用及机制作者：吴克俭，费素娟，刘军权，陈复兴【摘要】目的了解舒林酸是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ（PPARγ）途径影响人胃癌SGC-7901细胞的增殖，初步探讨PPARγ途径在舒林酸抗肿瘤作用中的机制。方法培养人胃癌SGC-7901细胞，经特异的PPARγ抑制剂GTT法）检测舒林酸对细胞增殖的影响及用免疫细胞化学法检测PPARγ、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果MTT法显示GTTassayshoangastriccancerSGC7901cellsent,annermunocytochemicalre

2、sultshoinistrationalone,theexpressionofPPAR-γprotEInoreffectofsulindac,andtheunderlyingmechanismisinvolvedintheactivationofPPARγ,theup-regulationofBcl-2expressionanddoangastrictumorSGC-7901;PPARγpathan公司；舒林酸、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；PPARγ、Bcl-2、Bax免疫细胞化学一抗、SP试剂盒均购自北京中

3、山生物工程公司。　　1.2实验方法　　1.2.1细胞培养　　胃癌细胞株SGC-7901用含10％小牛血清、双抗（青霉素1×105U/L及链霉素1×105U/L）的RPMI-1640培养液，以1×108/L的细胞密度接种入25ml的细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养。GI-1640培养液配制，均为现用现配。将舒林酸溶解于DMSO中，用RPMI-1640培养液将其配成浓度1.2mmol/L的原液存于-20℃冰箱内，按照实验要求用RPMI-1640培养基于磁力搅拌器中稀释溶解。　　1.2.2MTT法　　取对数生长期SGC-7901细胞配成1

4、×108/L，接种于96孔板中，每孔0.6ml，于37℃、5％CO2培养箱内培养，24h后加入GTT液20μl，37℃孵育4h后弃上清，每孔加入DMSO150μl，轻轻震荡使充分溶解，在540nm波长酶标仪上测定各孔光密度值（D值），求其平均值，同时计算细胞增殖率。　　1.2.3免疫细胞化学法检测PPARγ、Bcl-2、Bax蛋白表达　　待细胞生长融合度达到80%左右，除去培养液，4%多聚甲醛固定细胞15min，Triton破膜10min，滴加过氧化酶阻断液室温下孵育10min以阻断内源性过氧化物酶的活性，滴加正常非免疫动物血清，室温下孵育10mi

5、n，滴加相应一抗室温下孵育60min，分别滴加二抗和链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，DAB显色显微镜下观察，自来水冲洗，苏木素复染，盐酸分化，温水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，干燥后中性树胶封片，同时设置PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：PPARγ蛋白、Bcl-2、Bax均以细胞核染色为棕黄色或深棕黄色为阳性细胞。PPARγ蛋白以单纯细胞质着色而胞核无着色，或细胞核、细胞质均无着色为阴性。Bcl-2、Bax均以单纯细胞核着色而胞质无着色，或细胞核、细胞质均无着色为阴性。高倍镜下选取10个视野，计数1000个细胞中的阳性细胞数（即阳性细胞占计数细胞的百

6、分比）。　　1.3统计学处理　　实验数据采用SPSS11.0软件进行统计学分析，所得结果均以均数±标准差表示，检验水准：α=0.05。　　2结果　　2.1Gol/L递增时，作用于不同时间的人胃癌SGC-7901细胞，结果示当Gol/L且作用时间在24h时，其对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制的反转作用达最大值，可以得出其最佳浓度为0.5μmol/L，有效作用时间为24h。表1不同浓度的GW9662在不同时间对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响（略）　　2.2GTT测定结果如表2所示。舒林酸对SGC-7901细胞增殖有抑制作用，在各个时间点与阴性

7、对照组相比均具有显著性差异（P<0.01），且其作用具有时间依赖性。经PPARγ通路抑制剂GTT法结果显示，GA,DharDK,MasunagaR,etal.Sulindacandexisulindexhibitasignificantantiproliferativeeffectandinduceapoptosisinhumanhepatocellularcarcinomacelllines［J］.CancerRes,2000,60(8):2085-2089.　　［2］KimKY,SeolJY,JeonGA,etal.Thebinedtre

8、atmentofaspirinandradiationinducesapoptosisbytheregulationofb