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时间:2018-11-20
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1、RBX诱骨活性成分的分离与纯化论文.freelg高度纯化的蛋白质,组织学观察其活性发现植入小鼠股部第10日.freelaterial,re-constitutedbonexenografthavegainedmuchsuccessintherepairofbonedefectandbonenonunion.Tostudyrelativemolecularmassofosteoinductionproteininreconstitutedbonexenograft.METHODSUsingheparinsep
2、haroseCl-6Bchromatography,theosteoinductionproteininreconstitutedbonexenograft(bonemorphogeicprotein,BMP)purificationplantationintothethighmusclesofmouse.Usingsodiumdodecylsulfate-polyacry-lamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE),themolecularmassofpurifiedprotei
3、ncouldbeknog,andinvivobytheendof10thday,muchmorechondrocytesandcartilagematrixformandtrabeculaecanal-sobeenseen.FromSDS-PAGE,highlypurifiedproteinishomodinerproteinolecularmassof35×103,and22×103onreduction.CONCLUSIONThe35×103proteininreconstitutedbonexenog
4、raftolL-1脲/0.5molL-1GaCl/1mmolL-1NEMI)24h,提取上清,经透析、离心后得到粗制BMP,将其复溶于纯化液(4molL-1盐酸胍/0.5molL-1GaCl/1mmolL-1NEMI),上清再经透析、离心后得到了部分纯化的BMP.在0.08MPa负压下将其与牛松质骨载体(本校西京医院自制)按1∶5质量比复合,蒸馏水透析72h,冻干.1.2肝素亲和层析纯化取160mg部分纯化的蛋白复溶于10mL的平衡缓冲液中(BufferA:6molL-1脲/50mmolL-1Tris.HC
5、l/0.1molL-1NaClpH7.0),以20000g的速度离心30min,除去其中不溶的物质.用上清对160mm×10mm的肝素亲和层析柱加样(注意不要破坏凝胶表面).层析柱分别按次序用以下三种缓冲液洗脱,即含有0.1,0.15,0.5molL-1NaCl的BufferA溶液,分别收集洗脱下来的蛋白质,经透析、离心、冻干后保存,测质量.1.3生物活性检测选用雄性BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中心供给)10只,体质量(20±2)g,随机分成2组,每组5只.将冻干后的蛋白分别植入小鼠右侧股部肌袋中
6、,其中A组植入0.4mg纯化后的蛋白质,B组同时植入牛血清白蛋白作为对照.在术后第10日全部处死,取出植入物周围2cm的软组织.标本均经组织学常规处理,切片行HE染色,镜下观察异位成骨的情况.1.4蛋白相对分子质量的测定采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,它多用于蛋白质及核酸的Mr测定.将纯化后的蛋白质溶于含有二硫苏糖醇(DTT)或不含有DTT的样品缓冲液中,90℃加热3~5min,离心后用上清加样.电泳凝胶为50mLL-1的积层胶、125mLL-1的分离胶.电泳完毕后,用考马斯亮蓝R-250染色,再测
7、其相对分子质量.2结果将部分纯化的蛋白质加入层析柱后,洗脱液以120cmh-1的速度洗脱(Fig1所示).用BufferA洗脱时,未吸附的蛋白质基本都流出;改用BufferB液(含有0.15molL-1NaCl),洗脱吸附较弱的蛋白,从Fig1可见此时pH值下降,离子浓度增加,且有较大量的杂蛋白流出,称为B峰;用含有0.5molL-1NaCl的BufferC液洗脱时,获得C峰,此峰为我们主要收集的目的蛋白.A段蛋白与肝素亲和层析无亲和力,故弃去不用,将B峰、C峰收集的蛋白对四蒸水进行透析约24h,其间换液3
8、次.透析发现,C峰蛋白有白色絮状沉积,表明不溶于水;而B峰蛋白透析液仍澄清透明,均溶于水.将C份蛋白真空冻干后,测其质量为8.23mg,纯化近20倍.手术后的动物均未出现感染,生长良好.小白鼠于术后第10日处死,切片经HE染色后观察发现,A组所有标本切片上均可见到明显的软骨岛形成,软骨细胞大而圆,非常明显,在个别区域可看到条索状骨小梁的出现(Fig2),周围有少量淋巴细胞浸润;B组无任何变化.重组合异种骨自198
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