野生型pten基因对人多发性骨髓瘤细胞株rpmi8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响

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1、野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响作者：王素云成志勇邓凯陈浩姚丽杨静慈尚银涛潘崚【摘要】目的探讨外源性野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭活性的影响以及PTEN/FAK信号传导通路在细胞侵袭活性中的作用。方法将携带人野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(AdPTENGFP)及空载体腺病毒(AdGFP)体外转染至RPMI8226细胞。通过MTT法检测细胞生长曲线，Hoechst33342染色检测细胞凋亡，荧光定量PCR(FQPCR)检测PTEN及FAK

2、mRNA水平变化，ML)病人常见PTEN缺失〔4〕，强力提示PTEN在调节造血细胞增殖、凋亡、恶性转化中的作用。PTEN通过负调控多种信号传导途径，来调节细胞周期进展、细胞凋亡和肿瘤细胞迁移和侵袭。其中PTEN/FAK信号传导通路在影响细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为方面起着重要作用。既往尚无资料显示PTEN是否能够影响MM细胞的增殖和侵袭。因此，我们将重组腺病毒介导的野生型PTEN基因导入人MM细胞株RPMI8226，使PTEN基因在RPMI8226细胞中高表达，观察其对RPMI8226细胞增殖、凋亡和侵袭活性的影响，研究PTEN/FAK的表达

3、水平，以进一步了解MM发生发展中可能存在的分子机制，为探索MM基因治疗提供新思路。　　1材料与方法　　1.1材料重组腺病毒AdPTENGFP和AdGFP由上海吉凯生物公司合成并鉴定，在293A细胞中进行扩增及滴度测定。人MM细胞株RPMI8226细胞和人胚肾细胞系293A细胞均为本实验室长期保存细胞系。RPMI8226细胞用含15%胎牛血清(杭州四季青)RPMI1640培养基培养，293A细胞用含10%胎牛血清RPMI1640培养基培养，均在37℃、5%CO2，饱和湿度环境孵育。　　1.2病毒转染及效率的测定将100μl含病毒液的无血清培养液

4、加入RPMI8226细胞中，感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)为100，在37℃，5%CO2条件下培养2h，置于含15%胎牛血清RPMI1640培养液继续培养。流式细胞仪计算转染效率。　　1.3MTT法测定细胞抑制率取对数生长期RPMI8226细胞，分为对照组、转染AdGFP组、转染AdPTENGFP组，以1×104个/孔接种于96孔板培养，每组3个复孔，实验重复三次，每孔200μl。按MOI=100转染细胞，于不同时间点每孔加入MTT溶液，孵育4h后离心弃上清，另加入二甲基亚砜(DMSO)振荡数分钟，选择OD

5、490nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度A值。抑制率=(对照组A-试验组A)/对照组A×100%。　　1.4细胞凋亡率检测Hoechst33342染色检测细胞凋亡：分别收集转染后不同时间不同组的RPMI8226细胞，取100μl细胞悬液，加入荧光染料Hoechst33342至终浓度为10μg/mL。常温避光染色15min，取40μl细胞悬液，在激发波长为350nm荧光显微镜下观察结果并计数10个视野(200个细胞/视野)，计算凋亡细胞所占比例。　　1.5实时荧光定量PCR检测PTEN、FAK基因表达分组收集转染后3dRPMI8226细胞，Triz

6、ol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR反应：SYBR反应体系共25μl。反应条件为94℃5min，94℃45s，60℃1min，30个循环，设空白对照，记录循环阈值(Ct值)。根据△Ct=Ct目的基因Ctβactin，△△Ct=2-△Ct计算目的基因与βactin相对表达量。PCR引物由北京赛百盛生物公司合成，检测基因序列见表1。　　1.6I8226细胞，每组收集1×107个细胞，加入200μl预冷的蛋白裂解液4℃裂解1h，冰浴下超声裂解15min。12000r/min4℃离心20min，取上清，用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋

7、白浓度，分装后20℃保存。取80μg样品蛋白加入等体积上样缓冲液，经SDSPAGE凝胶电泳后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。经5%BSA37℃封闭1h，加入1∶500稀释的小鼠抗人单克隆抗体，4℃培育过夜。TBS漂洗5min×3次，加入山羊抗小鼠HRP标记二抗，37℃孵育1h，TBS漂洗5min×3次。化学发光法检测后分析结果。表1FQPCR扩增引物序列　　1.7Transg/LMatrigel胶4℃融化，用无血清RPMI1640培养基将其1∶8稀释混匀。200μl包被TransRNA(18.37±7.05)表达水平明显高于AdGFP组

8、(1.65±0.37)及未转染对照组(1.77±0.42)(P<0.01)。转染AdPTENGFP组蛋白表达水平