荧光金逆行标记大鼠视网膜神经节细胞

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1、荧光金逆行标记大鼠视网膜神经节细胞【摘要】目的将荧光金（flurogold，FG）注射于SD大鼠上丘，观察到被FG逆行标记的视网膜神经节细胞(retinalganglioncells，RGC)，以及SD大鼠RGC的数目及分布。方法用3%FG双上丘注射，逆行标记RGC。5天后做视网膜定向铺片，在荧光显微镜下距离视乳头中心上下左右各2mm拍摄照片。利用计算机图像分析系统做RGC计数。结果右眼RGC单位面积数量472.9±54.13，左眼RGC单位面积数量471.5±52.54。双眼RGC单位面积数量相比差异无显著性（P>0.05）。视网膜血管自视盘发出呈放射状

2、，血管走行区无标记细胞。距视盘2mm始RGC分布较致密，视网膜周边部细胞分布较为稀疏。结论用荧光金逆行标记上丘方法来标记RGC，是实验条件下研究RGC数量动态变化的可靠、有效方法。【关键词】视网膜神经节细胞；荧光金【Abstract】ObjectiveRetinalganglioncells(RGC)bersanddistributionofRGC.Fourphotographseveryquadrantoftheretina2mmfromthecenterofopticdisc.Retinalganglioncellsinedthroughafluoresce

3、ncemicroscopeafter5days，fourphotographseveryquadrantoftheretina2mmfromthecenterofopticdisc.RetinalganglioncellsbersofRGCbersofrighteyebersoflefteyeethodthatretinalganglioncells(RGC)retrogradelabeledbyinjectionoffluorogoldisreliableandeffective.【Keyl/kg进行麻醉，将其固定在脑立体定位仪上，0.5%碘伏消毒皮肤，于正中

4、切开皮肤向下分离达颅骨。牙科钻钻开颅骨相应部位，用微量注射器吸取3%FG（溶于0.9%生理盐水中），每侧上丘注射两点（前囟后5.9和6.4mm，旁开1.4mm，深4.0mm），每点注射1.5μl，留针5min。1.4视网膜定向铺片实验第5天，实验动物在深麻醉下，于上方12点处做球结膜缝线标记，立即取出眼球固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中2h。沿角膜缘后0.5mm剪开眼球，去除角膜和晶状体，分离视网膜并将其定向平铺，空气中自然干燥，市售无色指甲油封片。1.5荧光照片RGC计数在荧光显微镜下使用V波段荧光激发，距视盘中心2mm上下左右各拍摄照片1张，照片放大倍数125

5、×，分别代表上、下、左、右四个象限的RGC数量。1.6图像分析使用联想Mustek扫描仪将照片以100dpi扫入计算机，使用彩色颗粒分析软件（CPAS）进行节细胞计数，将上、下、左、右4张照片节细胞数量累加，代表该眼节细胞单位面积数量。1.7统计学方法使用SPSSfor>P=0.783讨论利用轴浆流逆向输送的特点，在颅内RGC投射的核团上丘、外侧膝状体［2］、视神经断端近眼球一侧放置辣根过氧化物酶或DiamididoYello.荧光金在紫外线照射下，其激发光波长323nm，发射光波长为408nm，标记的RGC呈金黄色强荧光，能标记细胞质，而细胞核不着色，能很好显

6、示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏，不易扩散，与周围组织分界清晰，除RGC层外，其余各层中均无荧光标记的细胞。Selles-NavarroI［6］等研究发现应用荧光金行上丘逆行标记RGC后，细胞质内荧光金的存在不超过3周，标记后12天、14天、21天与标记后37天有明显差异。随时间进展荧光金可能丢失荧光或被代谢［7］。该实验于动物处死前5天行荧光金逆行标记上丘，标记的RGC呈金黄色强荧光，各象限均匀。通过逆行标记RGC可以记录它的累积丢失，比通过凋亡标记（如TUNEL染色）更好，通过凋亡标记在一定的时间只能看到少量细胞［8］。此标记方法广泛应用于RGC的发生和凋亡

7、［9］、视网膜缺血［6］、视神经横断、视神经再生的研究。该实验的标记方法为两点法双侧上丘注射，因为有95%以上的大鼠RGC投射到上丘［10］，10%左右的RGC的轴突投射到同侧外侧膝状体。因此，采用对侧上丘注射标记单眼RGC的方法并不可靠，至少有10%的RGC不被标记。上丘注射法还包括一点法［10］、三点法［11］。以往我们也采取过每侧上丘注射一点的标记方法，发现这种方法能够成功标记RGC的比率比较低，而且对注射精度要求高，注射点必须位于上丘中心（前囟后5.3mm中线外2mm，深4.5mm）。如果注射偏离上丘中心位置，将导致视网膜RGC标记的不均匀。改用双侧上丘

8、两点注射法标记出的RGC