Brn-3a标记大鼠视网膜神经节细胞的实验研究-论文.pdf

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1、型2014April，v。148N。2JFujianMedUniv⋯～⋯⋯75Brn．3a标记大鼠视网膜神经节细胞的实验研究林俊，朱益华摘要：目的对比Thy-1．1标记大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)的方法，评估Brn-3a是否可作为一种可靠的内源性标记物，标记并计数大鼠RGCs。方法2O只SD大鼠，随机选取大鼠一眼为Thy一1．1组，另一眼作为Brn-3a组，常规H—E染色镜下观察RGCs的形态，运用免疫组织化学法检测Brn一3a与Thy一1．1的表达情况，每只眼球取1张切片，在每张待测视网膜切片上，以视网膜后极部中点为起点，至近角膜缘视网膜止点处，将视网膜分为3

2、等份，即中央区、中间区及周边区，每个区域视网膜随机取5个高倍视野，分别计数Thy—l_1、Brn一3a阳性细胞均数。结果光镜下正常大鼠的视网膜从内向外可见3个细胞核层，依次为神经节细胞层(GCL)、内核层(INL)、外核层(0NL)。GCL的细胞呈单层排列，较为整齐，胞核清楚，数目相对较少，INL和ONL呈多层排列，且细胞排列紧密，数目相对较多。2种标记物染色都仅仅存在于视网膜的GCL，但在大鼠RGCs中分布呈明显差异：Brn一3a主要在胞核中着色，Thy-1．1主要在胞质中着色；运用此2种标记物标记计数RGCs，各个相同区域内Thy一1．1和Brn-3a阳性细胞计

3、数比较，差别均无统计学意义(P>0．05)。Thy-1．1组和Brn-3a组中央区、中间区和周边区两两比较，差别均有统计学意义(P

4、抗体用小分子的标饲养室采用循环日光灯照射(12h光照／12h黑记剂，如荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金暗)，符合医学实验动物环境设施要求。实验动物的及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，并借助于荧管理遵循中华人民共和国卫生部颁布的《医学实验光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和动物管理实施细则》。发光免疫测定仪等精密仪器，以提高其灵敏度和便1．2动物分组大鼠20只，随机选取大鼠一眼为于检出的一类新技术。近年来，人们发现视网膜神Thy一1．1组，另一眼为Brn一3a组。分别利用小鼠抗经节细胞(retinalganglioncells，RGCs)内或胞体上

5、大鼠Thy一1．1单克隆抗体及小鼠抗大鼠Brn一3a单存在某些特异的抗原，因此尝试使用离体视网膜进克隆抗体对大鼠视网膜进行免疫标记，并通过免疫行免疫标记的方法定量检测RGCs。目前常用的免组织化学的方法观察RGCs的Thy一1．1与Brn一3a疫标记物为Thy一1．1抗体。本研究拟通过观察大的表达情况并计数。鼠RGCs形态结构，对比Brn一3a与Thy一1．1的表达1．3方法特点及计数差异，探寻Brn一3a是否为一种可靠的内1．3．1H—E染色过量麻醉大鼠，行3点钟位缝源性标记物，标记并计数RGCs。线标记，立即摘除眼球，浸泡于4多聚甲醛的固定液中。48h后沿角巩膜

6、缘切除眼前节，小心剥离晶1材料与方法状体，余下部分逐节脱水、透明、石蜡包埋，于视乳头1．1动物健康SD雌性大鼠2O只[由福建医科颞侧旁开1mm，做4／,m切片，烘干备用，常规H—E大学动物中心提供，合格证号：SGXK(闽)2004一染色镜下观察RGCs的形态。ooo2-1，体质量约200～250g。纳入标准：双眼角膜1．3．2免疫组织化学检测石蜡切片常规脱蜡至清亮、透明，瞳孔对光反射存在，无白内障等眼部疾水，3HO。孵育，阻断内源性过氧化物酶，微波抗患。正常饲养，饲养环境通风良好，室温18～25℃，原修复，2组分别滴加适当比例稀释的小鼠抗大鼠Thy一1．1单克隆抗体

7、及小鼠抗大鼠Brn一3a单克隆收稿日期：201402—2l抗体，4℃湿盒内过夜，然后按照通用型IgG抗体基金项目：国家自然科学基金(81270999)；福建省医学创新课题(2012一CX一24)(Fab段)一HRP多聚体试剂盒说明书步骤进行，加作者单位：福建医科大学附属第一医院眼科，福卅l350005作者简介：林俊(1986一)，男，住院医师，医学硕士新配制的DAB显色，显微镜下控制3～5min，PBS通讯作者：朱益华．Email：zhuyihua889@126．corn终止反应，自来水充分冲洗，苏木素复染，常规梯度林俊等：Brn-3a标记大鼠视网膜神经节细胞的