lhr真核表达载体构建以及表达

《lhr真核表达载体构建以及表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、LHR真核表达载体构建以及表达ok3inLei教授提供。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);DMEM培养基、G418、质粒载体pCDNA3.1(+)、pEGFP、脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、RNATrizol(美国Invitrogen公司);限制性核酸内切酶ApaⅠ(美国Promega公司),限制性核酸内切酶KpnⅠ及NheⅠ(美国纽英轮生物技术有限公司);1KbDNAladderMarker、小抽质粒抽提试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司);大抽质粒抽提试剂盒H

2、ispeedplasmidmidikit(25)(德国QIAGEN公司);RTPCR试剂(日本TaKaRa公司);cAMPEIAkit(美国Cayman公司);hCG(美国Sigma公司)。引物合成与测序由上海英骏生物技术有限公司完成。1.2方法参照文献[56]。1.2.1构建pcDNA3.1(+)LHR重组质粒KpnⅠ/HpaⅠ双酶切LHRcDNA质粒载体、KpnⅠ/EcoRV双酶切pcDNA3.1(+)载体,琼脂糖电泳分离,胶回收纯化,T4DNA连接酶将pcDNA3.1(+)载体与LHR

3、cDNA片段连接,构建的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)LHR,具体操作步骤按说明书。按常规方法将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含氨苄青霉素(100μg/mL)LB平板挑取单克隆,于2mLLB培养扩菌,小量快速抽提试剂盒抽提载体质粒。应用酶切图谱分析方法鉴定,选取酶切图谱分析结果鉴定的2个克隆载体DNA送上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。pcDNA3.1(+)LHR质粒载体在含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB中大量培养,用Hispeedplasmidmidikit

4、抽提质粒。1.2.2重组质粒转染MCF7细胞将MCF7细胞按每孔2×105接种于24孔细胞培养板(美国corning公司),24h后按每孔0.4μg及1μg分别将pcDNA3.1(+)LHR重组质粒及空载体质粒以LipofectamineTM2000转染入MCF7细胞,具体操作按试剂说明书。1.2.3筛选转染细胞转染24h后,加入400μg/mLG418筛选转染细胞,每隔2d换液,直至出现细胞克隆。用胰酶消化,在显微镜下挑取克隆,移至24孔板继续培养,G418筛选,并再次挑取单克隆细胞,大量

5、培养。1.2.4鉴定转染细胞1.2.4.1RTPCR鉴定根据已发表的LHR基因序列(NM013582)设计并合成引物。引物序列:F:5’ACAGCTGCTGGTGCTGGCAATG3’R:5’TCCCTTGGAAAGCGTTCCCTG3’RTPCR两步法扩增500bpLHR目的片段,扩增条件如下:反应经94℃预变性5min后进入循环;94℃变性45s→57.5℃退火45s→72℃延伸75s,扩增32个循环;循环结束后72℃延伸10min。取5μLPCR产物,琼脂糖凝胶电泳,观察有无特异目

6、的条带。1.2.4.2cAMP浓度测定方法鉴定将稳定转染LHR的MCF7细胞按每孔4×105接种于12孔细胞培养板,24h后弃旧培养基,用无血清DMEM培养基洗2遍,每孔加入含0,0.16,1.6,16IU/mLhCG的DMEM培养基0.4mL,置于体积分数为0.05的CO2、37℃培养箱培养2h,收集上清液,按操作说明书测定。2结果2.1重组质粒鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)LHR酶切图谱分析,琼脂糖电泳结果见图1。酶切图谱显示,酶切结果与pcDNA3.1(+)LHR重组载体酶切位点相符

7、。2.2测序结果以质粒pcDNA3.1(+)的通用引物BGH、T7为测序引物,测定结果显示pcDNA3.1(+)LHR载体中LHR序列与LHR基因序列完全符合。2.3转染细胞的筛选、鉴定重组质粒转染MCF7乳腺癌细胞后,经G418筛选,14d后24孔板上见G418抗性的细胞克隆形成。经2次筛选后转染重组质粒的细胞挑出8个克隆,提取细胞RNA,经ND1000紫外分光光度测定RNA浓度,经RTPCR扩增,发现转染重组质粒后细胞表达LHR,转染空载体细胞不表达目的LHR(图2),选择第8克隆细胞进

8、行实验。LHR属于G蛋白偶联受体超家族成员,对LH与hCG有高亲和性,cAMP作为第二信使,参与其信号转导。本实验通过检测hCG作用后转染LHR及空载体MCF7细胞内cAMP浓度(表1),证实转染LHR的MCF7细胞高表达LHR。3讨论hCG的主要生理功能是刺激卵巢黄体分泌孕酮,维持妊娠,促进乳腺发育。近年来的研究发现hCG具有抑制乳腺癌发生、发展的作用,针对hCG的表1hCG对乳腺癌细胞cAMP浓度影响研究可望能为乳腺癌的防治提供新的思路[79]。hCG在体内