细胞培养中细菌类微生物污染的快速检测

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1、细胞培养中细菌类微生物污染的快速检测［摘要］目的检测细胞培养中细菌类（包括支原体）微生物的污染情况。方法用细胞培养中常见的培养物人为污染He-La细胞，设计细菌类微生物16SrRNA基因序列通用引物，PCR扩增16SrRNA基因序列片断，建立PCR检测培养细胞污染的方法，并用该方法检测本室保存的细胞株的污染情况。结果人为污染绿脓杆菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌和支原体M.fermentans的Hela细胞的培养上清中均扩增出大小的片段，与目的片段相符。本室所收藏的15个细胞株有3株的培养上清中扩增出大小的

2、片段。结论本实验建立了16SrRNA基因序列通用引物PCR法，可用于快速检测培养细胞中细菌类微生物的污染。　　［关键词］细胞培养;细菌;污染;PCR　　Rapiddetectionofbacterialormicrobialcontaminationincellcultures　　Abstract:ObjectiveToinvestigateafastandsimplemethodtodetectbacterialcontaminationsincludingMycoplasmacontaminati

3、onincellcultures.MethodsHeLacellsidisandM.fermentans，respectively.Thesuit-abilityofPCRbasedontheuniversalprimersforthe16SrRNAgenesequencesofprokaryoticcellsforthedetectionofbacterialcontaminationinHe-LacellculturesethodplifiedfromalloftheHeLacellculture

4、scontaminatedbyP.aeruginosa，E.coli，S.epidermidisorM.fermentans.Ofthe15cellstrainsinourlabora-tory，3ethod.ConclusionThePCRmethodbasedontheuniversalprimersforthe16SrRNAregionofprokaryoticcellsmightbeusedfortherapiddetectionofbacteriaincellcultures.　　Keyin

5、ation;PCR　　细胞培养被微生物污染，是常见而又严重影响细胞培养后续研究工作的问题。微生物污染包括真菌类，细菌类（包括支原体）以及病毒类对培养物的污染。其中真菌污染后不难被发现，而病毒污染的检测应根据不同的病毒选用不同的方法，而且需要建立相应的参照系统，属于病毒学范畴，在普通实验室不易推广。细菌类微生物，特别是某些细菌和支原体污染后，对培养液无肉眼可见影响，是细胞培养中最常见，不易被察觉又干扰实验结果的问题［1-5］。因此，检测并消除细菌类微生物污染在细胞培养工作中至关重要。PCR技术用于检测培

6、养物中支原体污染的研究已有报道［1-4］，但由于培养物的DNA提取以及PCR技术本身要求的实验条件及成本较高，在普通实验室不易推广;设计的引物如果不能涵盖所有的支原体种也容易造成检测标本的假阴性［3］。本实验采用煮沸法粗提DNA，合成细菌类16SrRNA特异性序列通用引物，用PCR扩增法对培养物进行检测，真正做到廉价、灵敏、简便和快速。而且早期即可以检测到细胞培养中细菌类微生物的污染，对于污染后的挽救也有重要意义。　　1材料与方法　　1.1细菌参考株　　绿脓杆菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌，由本室保存;支

7、原体M.fermentans等，由北京军事医学科学院温博海教授惠赠。　　1.2细胞株　　无支原体污染的HeLa细胞，由保井孝太郎教授惠赠。作为阴性对照和实验室人为污染的细胞样品。本室所收藏的细胞系共15个细胞株。　　1.3实验室人为污染HeLa细胞　　分别刮取各种常见细菌冰晶，接种于LB培养基，支原体接种于牛心浸液，37℃过夜培养。取50μl上述培养物接种于新传代的HeLa细胞，共同培养。　　1.4细菌基因组DNA的煮沸法小量制备　　取各个感染组的培养上清，12000r.min离心30s，弃上清后加入

8、200μlPBS重悬，将重悬液于沸水（100℃）中煮5min，12000r.min离心15min，吸出上清移入一个新的EP管中，加入冰预冷的异丙醇200μl，于-20℃放置15min。12000r.min离心5min，弃上清，用50μlTE缓冲液重悬。　　1.5PCR扩增　　PCR扩增细菌类16SrRNA特异性序列通用引物［6-7］。上游引物（A-17）:5′-GTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物（3-17）:5′-AAGGAGGTAATC