mapks信号通路在雌激素调控人皮肤成纤维细胞增殖中的作用

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1、MAPKs信号通路在雌激素调控人皮肤成纤维细胞增殖中的作用南华大学附属第二医院湖南衡阳421000摘要：目的探究雌激素（17β-E2）调控人皮肤成纤维细胞（HSFB）増殖是否受到丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路（MAPKs）的影响。方法原代培养HSFB，按干预因素的不同将第四代细胞分为6组：空白对照组（A组）、17β-E2组（B组）、17β-E2+ICI-182780组（C组）、17β-E2+PD98059组（D组）、17β-E2+SP600125组（E组）和17β-E2+SB203580

2、组（F组）。同步化处理各组细胞P，以17β-E2直接刺激或经上述受体拮抗剂及激酶抑制剂预处理后再以17β-E2刺激。收集细胞，提取总RNA和总蛋白，分别利用荧光定量PCR和Western-Blot技术检测各组细胞增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA和蛋白的表达情况。结果1.B组的PCNAmRNA表达较A组显著增强（P<0.01）,但C、D组与B组相比其表达被显著抑制（P<0.05）；2.各组PCNA蛋白表达棊本与其mRNA表达相一致。结论：雌激素β受体（ERβ）及ERK/MAPK信号通路参与雌激素调控的

3、HSFB增殖过程。关键词：雌激素；成纤维细胞；雌激素β受体；激酶抑制剂；增殖HSFB是创面愈合的主要修复细胞，在其各个阶段它都起到重要作用。PCNA这种细胞周期调节蛋內，是反映细胞增殖活性的重要指标，在DNA复制屮起重要作用。研究表明，HSFB增殖、迁移等生物学行为与雌激素及其受体（ER）相关，ER受体后信号通路屮的激酶主要包括MAPKs、蛋白激酶A、蛋白激酶C、蛋白激酶G等，其屮MAPKs这组丝/苏氨酸激酶是介导胞外增殖信号到胞内反应的重要信号转导系统［1］。目前关于皮肤组织屮ER表达的报道存在争议［2-4］,而雌激素调控HSFB增殖

4、的受体后信号转导及具体作用机制更是有待阐明。本研宂拟应用ERβ受体拮抗剂ICI-182780和MAPKs激酶抑制剂PD98059、SP600125、SB203580来观察ERβ和MAPKs是否参与雌激素调控HSFB增殖过程。1材料与方法1.1主要材料17β-E2,ICI-182780,SP600125,SB203580,PD98059,PCNAMAB一抗，GAPDH—抗1.2主要方法1.2.1分离细胞：标本来自一名行包皮环切术的健康男性，消毒后采用酶消化法进行HSFB分离及原代培养，传代后取第4代用于实验。1.2.2

5、细胞分组及药物干预：将细胞按不冋干预因素分为6组：空白对照组（A组）、17β-E2组（B组）、17β-E2+ICI-182780组（C组）、17β-E2+PD98059组（D组）、17β-E2+SP600125组（E组）和17β-E2+SB203580组（F组）。药物干预：A组：无血清DMEM同步化24h;B组：同步化后给予17β-E2作用浓度为10-10mol/L的条件培养基作用48h;C组：M步化后给予ICI-182780作用浓度为25μmol/l的条件培养基作用lh，再换用B

6、组所用的条件培养基作用48h;D、E、F三组处理过程均冋C组，PD98059、SP600125和SB2O358O在条件培养基中作用浓度分别为50μmol/L10μmol/l及10μmol/l;48h后收集各组细胞。1.2.3总RNA的提取及蛋白样品制备：提取每组冻存裂解细胞、tiRNA，溶于40μIDEPC中，放入2mlEppendorf管中，加入500ul预冷的裂解液，冰上匀浆，4°Cl2000r/min离心15min，取上清，共2次，Bradford法进行蛋白定量，-20°C保存。1.2.4实吋荧光定量PCR检测PCN

7、AmRNA表达水平：GenBank上査找PCNA和GAPDH（内参）的cDNA序列，Primer5.0设计特异性引物序列，由上海生工合成。构建50ul反应体系。每组设3个平行复孔，在ABIPRISM7300RealtimePCR仪上进行扩增反应。反应结束后，根据荧光动力增长曲线自动分析计算出样品Ct值，采用2-AACt相对定量法得出各组样品PCNAmRNA的相对表达量。1.2.5免疫印迹Western-Blot检测PCNA蛋白表达水平：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳；（2）转膜；（3）抗体封闭；（4）化学发光显影。凝胶成像系统扫描片子并分析结果，结果以

8、PCNA和GAPDH积分光密度值（IOD）比值表示。1.3统计学分析数据以均数±标准差（±s）表示，采用SP