双元表达载体系统

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1、双元表达载体系统双元农达载体系统主要包括两个部分.•一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T一DNA区域，完全丧失了致瘤作川，主要是提供Vir蕪因编码表达Vir蛋白的功能，V旧基因编码的virD2蛋白ffl当于反式作用元件，能够识別农杆菌转运DNA(T-DNA)两端24bp序列，进而将T-DNA以单链的形式切割下來，同吋，VIR基因编码的virE2能够与单链TDNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作川K,经过宿1:细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。之后便足宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T-DN

2、A的转移。另一部份是微型Ti质粒(Mini-Tiplasmid),它在T-DNA左右边界序列之间提供桢株选择标记如NPTII基因以及LacZ基因等。双元载体系统的构建的原理足Ti质粒上的Vir基因可以反忒激活T-DNA的转移。与共整合载体所不M的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要丼整合过程就能在农钎菌内独立复制。原理1.一般植物表达载体足成春使川的，一審屮有两个，一个是带奋可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白(通常是GFP或Gus)的普通载体。：W—个载体就是双元载体(binary-vecto

3、r)丫。通常我们是先将外源眾因插入带冇筛选标记的载体，然后将此载体上的35Spromoter-expressiongene-gfp这段全部切卜'，然后构建亚克隆，其过程就楚将I:述的R断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。然后将带冇35Spromoter-expressiongene-gfp的双元载体转化农杆菌，介:通过农杆菌转染桢物，敁后口丁以通过农杆菌特奋的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。我以前川的楚pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及

4、pZPZ211和pAA等2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.—部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T一DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir®因功能，激活处于反式位置上的T—DNA的转移。4.另一部份是微型Ti质粒(Mini-Tiplasmid),它在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择记如NPTII基因以及LacZ基因等。5.双元载体系统的构建的原理足Ti质粒上的ir菽因可以反式激活T一DNA的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的冋源序列，不耑要;R•整合过程就能在农杆尚A独立

5、父制。6.外源DNA*隆到微型Ti质粒T一DNA左右边界序列之间双元载体磯：植物双元表达载体根癌农杆荫(Agrobacteriumtumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤细荫，能够通过感染祖物的伤口，将其Ti质粒上•-•段含有植物激素和遗瘿碱合成酶基因的DNA转移并整合至椬物受体的基因组中。Ti质粒中的2个独立的区域决定DNA转移及整合：T-DNA区(transferredDNA)和vir区(virlenceregion)。莊于Ti质粒这个结构特点，1983年Hoekema等提出双元载体策略：将去除致瘤某因的T

6、-DNA区从Ti质粒中分离，放置在一个能在农杆菌和人肠杆菌中复制的穿梭质粒中。这个穿梭载体称为双元Ti载体。vir区则存在于一个已经除去T-DNA的Ti质粒屮，在农杆菌屮作为辅助质粒，通过反式激活使T-DNA转移到梢物细胞菽因组中。由于双元Ti载体的体积小而非常便于®因兑隆操作，所以逐渐取代了其它形式的Ti载体，己成为拊物基因工程中最重:耍的桢物转化载体。(1))病毒载体系统:梢物病毒作为梢物遗传转化的载体系统是巾植物病毒的侵染特性所决定的。以病毐作载体的表达系统为瞬时表达系统，K一般不能把外源荃因整介到梢物细胞基

7、因组中。植物祸毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。但因以病毒为载体的表达系统每个佾主材料都要接种病毐载体，故瞬吋表达系统不易起始。作为病毒载体的病毒最好足双链dna植物病毒。n前匕乜十儿种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中:ti括椰菜叶病毐(CaMV)、烟草花叶摘涛(TMV)、更豆花叶病毒(CPMV)和马铃薯X病毒(PVX)等。其巾在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。(2)农杆菌质粒载体系统:质粒载体系统中敁常川的质粒冇:Ti质粒和Ri质粒。r质粒存在于根癌农杆齒(Agroba

8、cteriumtumcfaciens)中，Ri质粒存在于发根农打•歯(Agxobac[eriumtlhixogenis)中。r质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有荃本一致的特性。似实际工作中，绝大部分采用五质粒。农朴荫质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。r质粒冇两个区域:T-DNA区〔是质粒上能够转移整合入植物受体墓因组并能在植物细胞中表