细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验.doc

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1、细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的应用细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的应用药学院陆渊指导老师郁韵秋摘要：本实验拟采用体外培养小鼠脑微血管内皮细胞（BCECs）的方法，研究伊曲康唑对BCECs上P-gp功能的影响。实验将主要包括建立细胞裂解液中罗丹明123的HPLC-FLD的检测方法，并进行方法验证；小鼠脑微血管内皮细胞的分离、纯化和培养；RH123细胞摄取实验以及数据的处理和分析。通过本实验对伊曲康唑对P-糖蛋白功能的潜在影响进行探究。建立一种细胞裂

2、解液中罗丹明123的HPLC的检测方法，并将其应用于研究伊曲康唑对小鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。关键词：罗丹明123、BCECs、P-糖蛋白、HPLC、伊曲康唑、细胞裂解液Abstract:TheaimofthisstudyistofigureoutwhetherItraconazoleisaninhibitorofP-gp.Toachievethis,weusebraincapillaryendothelialcells(BCECs)asamodelandRhodamine123asthesub

3、stratetoevaluatetheeffectofItraconzaoleonP-gp.Asensitiveandrapidhigh-performanceliquidchromatography(HPLC)methodwithfluorometricdetectionaftersimplesamplepreparationprocedurewasdevelopedforthedeterminationofRh123inP-gpeffluxstudies.Thismethodhasbeensuccessfu

4、llyappliedtothequalificationofRhodamine123incelllysateobtainedfromP-gpeffluxstudyconductedinbraincapillaryendothelialcellsandcanbeemployedfordeterminationofthepotentialeffectonP-gp.Keywords:Rhodamine123,BCECs,P-gp,HPLC,Itraconazole,celllysate12细胞裂解液中RH123的HP

5、LC的检测方法及其在细胞摄取实验中的应用前言伊曲康唑(Itraconazole，ITZ)是一种高效、广谱的口服三唑类抗真菌制剂，临床用于治疗浅部和深部的真菌感染，其对人体的毒副作用较小[1]。两性霉素B和伊曲康唑联合使用，能有效提高治疗效果，但两者的相互作用机制仍不明确。有观点认为[2]，具有高组织亲和性的伊曲康唑，能够与血脑屏障上存在的P-糖蛋白结合，抑制其将药物从脑组织转运回血液的功能，从而保证两性霉素B在脑组织中维持有效的治疗浓度。1.课题背景1.1P-糖蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-

6、gp)是一种分子量为170ku的跨膜糖蛋白，由1280个氨基酸残基组成，具有12个跨膜区和2个细胞内ATP连结点。P-gp由多药耐药(multidrugresistance,MDR)基因编码，而MDR基因可分为有外排作用的P-gp(包括人MDRI、小鼠和大鼠的mdr1a和mdrlb和仓鼠的P-gp1和P-gp2)和无外排作用的P-gp(如人的MDR2也称MDR3、小鼠和大鼠的mdr2和仓鼠的P-gp3)。P-gp外排作用的生物学实质为细胞对生存环境中可能遇到的细胞毒物(或药物)加以排斥，降低细胞内该毒物(或药物

7、)的积累而达到自我保护。P-gp分布广泛，在肿瘤细胞和血脑屏障等正常组织上都有表达。P-gp转运物质的分子量从250Da到1850Da不等。被P-gp转运的化合物一般都含有芳族基，多数被P-gp高效转运的化合物是碱性或不带电的。所有被P-gp转运物质的共同结构特点是多少都含有疏水成分，P-gp的转运功能依赖药物插入膜脂质双层的能力（即药物的疏水性）。1.2血脑屏障上P-糖蛋白的表达血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)由脑毛细血管内皮细胞(braincapillaryendothelialcel

8、ls,BCECs)、基膜和胶质细胞足突3部分构成。BBB的主要作用是保护脑免遭毒性物质的损害和维持脑内环境的稳定，这一作用部分是通过BCECs上P-gp的外排作用实现的。BBB能阻止大部分亲水物质的通透，亲脂性化合物则可以通过脂溶性扩散的方式通过BBB。然而Levin早在70年代就发现某些亲脂性化合物难以通过血脑屏障的现象不能用以前的脂溶性扩散的理论来解释[3]。后来研究发现构成BBB