细胞裂解实验方法总结

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1、细胞裂解是改变细胞通透性和活性的重要实验方法。主要分为化学法和机械法，前者比较温和，后者虽然产量高，但反应更剧烈，很有可能造成细胞中的DNA断裂。本文主要是介绍细胞的裂解方法以及实验过程中的方法探讨。裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA断裂。这两种方法(包括SDS和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA的断裂。一、机械裂解法主要有以下两种：1. 热休克(Thermalshock)，既反

2、复冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成(freezingandthawing)，。原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20  ℃ 冰上进行，解冻可以在37、50、65或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。2. 超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法，把细胞破碎。但这种处理会导致DNA的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保

3、护酶的活性。bead-beating也是常用的机械处理方式，有报道指出bead-beating比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好虽然DNA产量较高，但通常得到的DNA片段较小。二、化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)主要是裂解液处理法，细胞裂解液的主要目的有以下几种：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。主要根据不同的目的，裂解液的组成有所不同，主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA或DNA时，我们主要是要充分裂解细胞，得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白，那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液，在提取蛋白后，

4、再根据实验需要复性蛋白等。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用：50mMTris-HClpH7.4(缓冲体系)，150mMNaCl(等渗体系)，1mMPMSF(强大的蛋白酶抑制剂)，1mMEDTA(变性剂和稳定剂)，5µg/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂)，5µg/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂)，1%Tritonx-100(破坏细胞)，1%Sodiumdeoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂)，0.1%SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。7M尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解)，蛋白酶K等。细胞裂解时间把握问题：孔板里细胞用PBS洗2次后，加入细胞裂解液，然后去测总蛋白

5、含量和酶的活力，不知道细胞要裂解到什么程度?答：因为所用的细胞类型不一样，所以实验的条件也需要摸索，建议这样来做：加入细胞裂解液后，不同时间取样，以时间和总蛋白含量和酶的活力作曲线，这样就可以找到裂解的最佳时间，仅供参考。原核表达的细胞裂解问题：做原核表达，用BL21表达，之后如何裂解细胞才行呢?我的菌液只有300微升，说明书上用超声裂解细胞，但没给出具体做法，我们这只有大的探头，不好做，有什么好的办法么? 要是用超声裂解，要怎么做才行?我是超声15s间隔10s座4次。裂解不好，应该怎样改呀?!答：请试一试IFCC推荐法：1. 收集细胞悬液2. 4  ℃  低温离心(3000rpm，5

6、min)3. 弃上清，加入一定量PBS(200ul)，轻轻吹打混匀，-20  ℃  冷冻30min， 37  ℃  解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液三、westernblot细胞裂解方法个人小结：过些天准备做westernblot，昨天就提前把细胞裂解了，提出蛋白来保存。一下是我做的方法，大家参考，可能有不正确的地方，希望大家指出来，谢谢!1. 取一瓶细胞(100ml的瓶子)，PBS洗2次，胰酶消化，加入10ml培养液，制备成细胞悬液；2. 将细胞悬液移入10ml离心管中，4  ℃ ，2500rpm，离心5min；3. 弃上清，加入预冷的PBS(即4  ℃ 存放的PBS)于离心管中

7、，吹打，4  ℃ ，2500rpm，离心5min；弃上清，重复上述步骤一次；共洗细胞2次，充分洗掉培养液；4. 弃上清，加入200ul细胞裂解液(每1ml裂解液中加入10ulPMSF)，置于冰上，裂解40min～1h；裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，以使蛋白充分裂解；5. 取出离心管，于4  ℃ ，12000rpm，离心5min；6. 将上清移入EP管中，-20  ℃ 保存，即可。注：本来应该在培养瓶或培养皿中裂解，但出于某种原因，我为