menke体外产气法

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1、Menke体外产气法（Syringe系统）——管子（一）基础知识体外产气法主要理念通过体外产气装置模拟瘤胃发酵体外产气系统组成体外产气装置：产气管（相当于独立的瘤胃）、恒温水浴摇床（模拟瘤胃温度和蠕动速度）；微生物培养液：由瘤胃液与人工唾液按1:2的体积比混合，搅拌均匀而成影响实验成败的主要因素实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键（二）试验前准备试配产气管①更换注入口处老化的塑胶管；②试配外管和内塞，要求推拉自如又不过松（现已将可匹配的外管和内塞统一编号，依号装配即可）。称量样品①产气管编号；②用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200mg（

2、DM），置于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁；③样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。配制原液正式实验前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放，配制方法见附表1）。其它①调试恒温水浴摇床的温度至39±0.5℃，摇动速度5×10转/min，如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致，另外还需要将一多联水浴锅温度调至39±0.5℃（以实际量取温度为准）；②准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；③贮备两瓶热水，准备收

3、集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。（三）正式试验配制人工唾液①将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后；②计算人工唾液需要量：体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；③配制还原剂（E液，见附表1）；④按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液

4、。①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应经常用热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；④用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。吸取微生物培养液用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。记录初始微生物培养液量排气过程：将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内

5、空气；读数：将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。空白对照和标准对照26实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空白对照）。空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液，标准干草对照以200mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml微生物培养液。为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。整个过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min记录产气量培养2、4、

6、6、9、12、24、36、48、72、96h时（试验样品为粗料，一般培养到72h或96h；精料一般培养到24h或48h即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。产气量计算（管子）式中，GPt为样品在t时刻的产气量（ml）；Vt为样品发酵t小时后，产气管刻度读数（ml）；V0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml）；W为样品干物质重（mg）；GP空白为空白对照在t时刻的产气量，其计算方式与GPt一致。重复试验要求体外产气试验

7、至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。(四)样品采集测定项目取样时间取样部位取样量重复数处理保存温度VFA实际需要上清液1ml-加入0.2ml8.2%偏磷酸，20000g离心10min4℃NH3-N24或48h混合液5ml--20℃MCP24或48h混合液24ml--20℃附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液