《食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测》（征求意见稿）.doc

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1、DBS江苏省地方标准DBS32/XXXXX—XXXX食品安全地方标准食源性致病微生物快速检测公开征求意见稿XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施江苏省卫生和计划生育委员会发布DBS32/XXXXX—XXXX前言本标准系首次发布。4DBS32/XXXXX—XXXX食品安全地方标准食源性致病微生物快速检测     1　范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血

2、性弧菌和志贺氏菌的快速检测。2　设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1　实时荧光PCR仪。2.2　冷冻离心机：12000r/min，4℃。2.3　均质器。2.4　恒温空气振荡摇床：36℃±1℃、30℃±1℃、42℃±1℃。2.5　恒温水浴锅：95℃±1℃。2.6　天平：感量0.01g。2.7　冰箱：4℃、-20℃。2.8　微量移液器：0.1μL-2.5μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL。2.9　灭菌吸头：10μL、200μL、1000μL。2.10　厌氧培养装置。2.11　灭菌1.5mL离心管。3　试

3、剂与培养基3.1　PCR实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格，121℃高压灭菌30min。3.2　TaqDNA聚合酶：5U/μL。3.3　脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）：10μmol/L。3.4　DNA提取试剂：称取0.1gChelex100粉末，加水定容至100mL，保存于-20℃备用；或使用商品化的DNA提取试剂盒。3.5　10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。3.6　引物和探针：引物和探针序列见附录A，加水稀释至10mmol/L，其中探针的5’端标记FAM，3’端标记TAMRA

4、。3.7　培养基3.7.1　7.5%氯化钠肉汤：见GB4789.10。3.7.2　缓冲蛋白胨水（BPW）：见GB4789.4。4DBS32/XXXXX—XXXX1.1.1　亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见GB4789.4。1.1.2　四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见GB4789.4。1.1.3　李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见GB4789.30。1.1.4　改良EC肉汤：见GB/T4789.36。1.1.5　3％氯化钠碱性蛋白胨水：见GB4789.7。1.1.6　志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见GB4789.5。2　操作步骤2.1　样品制备和增菌培养2.1.1　金

5、黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌的样品处理与增菌液选择按照GB4789.10，7.5%氯化钠肉汤增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200r/min振摇8h。2.1.2　沙门氏菌沙门氏菌的样品处理与增菌液选择按照GB4789.4，BPW增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200r/min振摇4h；移取0.1mL，转接种于10mLSC增菌液和TTB增菌液中，分别置于36℃±1℃和42℃±1℃恒温空气振荡摇床，200r/min振摇4h。2.1.3　单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌的样品处理与增菌液选择按照GB4789.30，LB1增菌液放置于恒温空

6、气振荡摇床中，30℃±1℃、200r/min振摇4h；移取0.1mL，转种于10mLLB2增菌液内，30℃±1℃，200r/min振摇4h。2.1.4　大肠埃希氏菌O157：H7大肠埃希氏菌O157：H7的样品处理与增菌液选择按照GB/T4789.36，改良EC肉汤增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200r/min振摇8h。2.1.5　副溶血性弧菌副溶血性弧菌的样品处理与增菌液选择按照GB4789.7，3％氯化钠碱性蛋白胨水增菌液放置于恒温空气振荡摇床中，36℃±1℃、200r/min振摇8h。2.1.6　志贺氏菌志贺氏菌的样品处理与增菌液选择按照GB478

7、9.5，志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素增菌液放置于厌氧培养装置中，41.5℃±1℃厌氧培养8h。2.2　致病菌DNA提取取4.1中培养的增菌液1mL，加入1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，吸弃上清；加入50μLDNA提取试剂（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后置于95℃±1℃水浴5min，12000r/min，4℃离心5min，取上清保存于-20℃备用。注：也可使用商品化的细菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取致病菌DNA。4DBS32/XXXXX—XXXX1.1　实时荧光PCR检测1.1.1　配置PC