dna靶向性甲基化酶表达及功能的研究

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第四军医大学硕士学位论文DNA靶向性甲基化酶的表达及功能研究姓名：邢克飞申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：药立波;刘新平20070501 第四军医大学硕士学位论文缩略语表缩略语英文全称中文全称AAaminoacid氨基酸Ampampicilin氨苄青霉素AOXalcoholoxidase乙醇氧化酶APammoniumpersulfate过硫酸铵bpbasepairs碱基对BSbindingsequence锌指结合序列BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白cDNAcomplementaryDNA互补DNADnmtDNAmethyltransferaseDNA甲基化酶DTTdithiothreitol二硫苏糖醇EBethidiumbromide溴化乙锭E.coliEscherichiacoli大肠杆菌EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸（钠盐）G-418geneticin新霉素Hishistindine组氨酸HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HSVherpessimplexvirus单纯疱疹病毒IPTGisopropyl-thio-β-D-galactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷kDkilodolton千道尔顿LBLuria-Bertani（medium）LB（培养基）-1- 第四军医大学硕士学位论文独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其它用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其它复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。论文作者签名：导师签名：日期：-1- 第四军医大学硕士学位论文DNA靶向性甲基化酶的表达及功能研究硕士研究生：邢克飞导师：药立波教授第四军医大学生物化学与分子生物学教研室西安710032摘要DNA甲基化、组蛋白修饰和DNA重构等，在不改变DNA原有的碱基配对特性和编码信息基础上，给DNA增加了新的可以遗传的信息，这些修饰称之为表观遗传学修饰。DNA甲基化在高等真核生物的发育分化、基因表达模式的时空调控以及基因组的稳定性中都起着十分关键的作用。DNA甲基化酶包括从头甲基化酶和和维持甲基化酶两种类型；在哺乳动物细胞中，目前已鉴定的从头甲基化酶有Dnmt3a和Dnmt3b，维持甲基化酶为Dnmt1。从头甲基化酶主要向DNA上引入新的甲基化，对底物DNA没有选择性；维持甲基化酶Dnmt1对底物DNA具有选择性，它优先地识别和催化一条链已被甲基化（或称之为半甲基化）的双链DNA，它的主要功能是在DNA复制中将母链的甲基化模式忠实地拷贝到新生链上，这也正是DNA甲基化修饰能够遗传的分子基础。从头甲基化则保证了甲基化的动态性以及对环境的适应性。大量研究表明，DNA甲基化和基因沉默紧密相关，一般情况下，基因启动子区CG岛-3- 第四军医大学硕士学位论文的甲基化导致基因表达的关闭，或称为沉默。DNA甲基化引起基因沉默的特性提示：选择性地关闭基因的表达可以通过靶向性甲基化来实现，即将DNA甲基化修饰特异性地引向靶基因的启动子或基因表达调节区的CG岛。随着近年来人造锌指蛋白设计和文库筛选技术的迅速发展，使得获得针对任何特定基因序列的定制化DNA结合蛋白（锌指蛋白）成为现实。现已成功地使用特异性识别HSV早期启动子IE175KVP16结合序列的锌指蛋白引导甲基化酶对该启动子序列的高度甲基化和基因沉默，以及对COS细胞内感染的HSV病毒复制的显著抑制。为了提高靶向性DNA甲基化技术的普遍适用性，我们将探讨用人造锌指蛋白引导靶向性DNA甲基化，这也将是对锌指蛋白技术应用的一个富有创新性的拓展。为了解决上述问题，我们将构建和重组表达人造锌指蛋白引导的靶向性DNA甲基化酶，在体外分析其靶向性甲基化的特异性及效率等性能参数，为细胞内靶向性甲基化提供必要依据；然后以酵母作为模型，通过同源重组将靶基因序列定向整合入酵母基因组，观察和分析靶向性DNA甲基化酶在酵母染色质水平对靶基因的甲基化效率以及特异性。基于以上陈述，本实验旨在原核系统和毕赤酵母中表达纯化DNA靶向性甲基化酶，对靶向性甲基化酶功能进行生化分析：对靶底物和非靶底物的亲和特性，甲基化酶的活性保持，对靶底物和非靶底物的DNA甲基化效率，以及靶向性甲基化的有效范围进行分析；同时，酵母基因组不含我们使用的锌指蛋白识别和结合的序列，将锌指蛋白识别的DNA结合序列定点引入酵母基因组中-4- 第四军医大学硕士学位论文设计人造靶基因（结合位点周围序列）。通过重硫酸盐测序法分析靶向性甲基化酶在酵母染色体上的甲基化情况，为后继深入的研究工作打下基础。本实验按如下方案展开：1.靶向性DNA甲基化酶的克隆以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒为模板，进行PCR以扩增B1-3a-Myc-6His的DNA片段，回收和纯化PCR产物并将其插入到pMD19-T载体中进行克隆后测序分析，用BLAST程序验证测序结果。2.靶向性DNA甲基化酶B1-3a的原核表达将测序正确的片段插入到pET32a原核表达载体中，用IPTG诱导表达，表达产物为包涵体。3.靶向性DNA甲基化酶B1-3a在毕赤酵母中表达以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒为模板，进行PCR以扩增DNA，回收和纯化PCR产物并将其插入到pPIC3.5k酵母表达载体中进行克隆后测序分析，用BLAST程序验证测序结果。融合表达的B1-3a-Myc-6His蛋白仅有少量可溶性表达，绝大多数蛋白为包涵体。酵母裂解上清经Ni-NTA偶联的琼脂糖珠纯化后，获得纯化蛋白并进行肽指纹图谱分析。4.将锌指蛋白识别的DNA结合定点引入酵母基因组设计人造靶基因以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒为模板，设计3'端引物，通过两次PCR将B1-3a的结合序列（bindingsequence，BS）连接至B1-3a-Myc-6His下游，回收和纯化PCR产物并将其插入到pPIC3.5k酵母表达载体中进行克隆后测序分析，-5- 第四军医大学硕士学位论文用BLAST程序验证测序结果。通过同源重组将靶基因序列定向整合入酵母基因组。5.靶向性甲基化酶在酵母染色体水平的甲基化情况分析提取整合有B1-3a-Myc-6His-BS序列的B1-3a已诱导表达的酵母基因组，用重硫酸盐处理后的产物为模板进行PCR，回收和纯化PCR产物并将其插入到pMD19-T载体中进行克隆后测序分析，用BLAST程序比对测序结果。关键词：DNA甲基化酶；毕赤酵母；亲合层析；特异性；DNA靶向性甲基化；基因沉默；表观遗传学修饰；-6- 第四军医大学硕士学位论文TheExpressionofDNATargetingMethyltranferaseAndtheStudyofItsFunctionCandidateformaster:XingKefeiSupervisor:YaoLiboDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology，FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，ChinaAbstractDNAmethylation,modificationsofhistone,DNAremodeling,etc,whichincreasestheinheritableinformationofDNAwithoutthechangesoftheprimarypropertyofbasepairingandencodinginformation,arecalledepigeneticmodification.Intheadvancedeukaryoticorganisms,DNAmethylationplaysacriticalroleinthedevelopmentanddifferentiation,temporalandspatialregulationofgeneexpressionaswellasthemaintenanceofgenomicstability.DNAmethyltransferasecanbedividedintotwotypeswhichareresponsiblefordenovomethylationandmaintenancemethylation,respectively;inmammaliancells,theidentifiedprimarydenovomethyltransferaseareDnmt3aandDnmt3bandthemaintenancemethyltransferaseisDnmt1.ThemainfunctionofthedenovomethyltransferaseistointroducenewmethylatedDNAsitesandit-7- 第四军医大学硕士学位论文doesnothaveselectivitytothesubstrateDNA;themaintenancemethyltransferaseDnmt1hasselectivitytowardsitssubstrateDNAanditpreferentiallyrecognizesandcatalysesthedouble-strandDNAwithonemethylatedstrand（namedhemimethlateddouble-strandDNA）sothatitsmainfunctionistocopythemethylationpatternoftheparentchainintothenascentchainduringDNAreplicationwhichisalsothemolecularbasisfortheinheritanceofDNAmethylation.Thedenovomethylationguaranteesthedynamicstateandtheadaptabilitytotheenvironment.AgreatdealofstudiesindicatedthatDNAmethylationiscloselyrelatedwithgenesilencing.Generally，themethylationofCGislandsinthepromoterregionofageneresultsthecloseofthegeneexpressionorso-calledgenesilencing.ThepropertyofgenesilencinginducedbyDNAmethylationsuggestedthattheselectivecloseofgeneexpressionmaybeacquiredthroughspecificDNAmethylationwhichistospecificallyintroducethemodificationofDNAmethylationintotheCGislandsofthepromoterortheexpressionregulatingregionofthetargetgene.TherapiddevelopmentofthedesignationandlibraryscreeningtechnologyofartificialzincfingerproteinsinrecentyearsturnsitintorealitytoacquiretheengineeredDNAbindingprotein（zincfingerprotein）targetinganyspecificgenesequence.Inonestudy,theengineeredzincfingerprotein,whichbindsVP16siteinthepromoterIE175ofHSV,wasfusedwithDNAmethyltransferase,andrecombinantproteininducedthehypermethylationofthepromoter-8- 第四军医大学硕士学位论文andthegenesilencingaswellasthesignificantinhibitionofHSVvirusinCOScells.ToincreasethegeneralapplicabilityoftargetedDNAmethylationtechnology,wewillexploitthetargetedDNAmethylationspecifiedbyartificialzincfingerproteinandthiswillalsobeacreativeexpandingoftheapplicationofzincfingerproteintechnology.Tosolveabove-mentionedproblems,wewillconstructandexpresserecombinantDNAmethyltransferasespecifiedbyartificialzincfingerprotein,exertexvivoanalysisofitsfunctionalparameterssuchasitsspecificityandefficacyoftargetedDNAmethylationtoprovidenecessarybasisfortheintracellulartargetedDNAmethylation;then，takeyeastasthemodeltoobserveandanalyzetheefficacyandspecificitytothetargetgeneofthetargetedDNAmethyltransferaseatyeastchromaticlevelthroughorientedintegrationofthetargetgenesequencebyhomologousrecombinationintotheyeastgenome.Basedonabovestatements,theaimofourexperimentistoexpressandpurifytargetedDNAmethylatransferaseinprokaryoticsystemandPichiayeastandconductbiochemistryanalysisofitsfunction:affinityfeaturestothetargetsubstrateandnon-targetsubstrate,themaintenanceoftheactivityofmethyltransferase,theefficacyofDNAmethylationtotargetsubstrateandnon-targetsubstrateaswellasthevalidrangeoftargetedDNAmethylation;meanwhile,theyeastgenomedoesnotcontainthesequencewhichrecognizedandbindedbythezincfingerproteinhereweusedand-9- 第四军医大学硕士学位论文weintroducedtheDNArecognizedbythezincfingerproteinintothefixed-pointofyeastgenometodesignartificialtargetgene（thenearsequenceofbindingsite）.UsethebisulfatesequencingmethodtoanalyzethemethylationcausedbythetargetedDNAmethyltransferaseatyeastchromatinleveltoprovidesomebasisforthefollowingstudies.Thestudywascarriedoutasthefollowingproposal:1．CloningoftargetedDNAmethyltransferase.TookpcDNA4-B1-3a-Myc-6Hisplasmidkeptbyourlaboratoryasthetemplate，amplifiedtheDNAbyPCR，recoveredandpurifiedthePCRproductandinserteditintopMD19-Tvectorandsequenced.SequencesthusobtainedwerevalidatedtoGenBankdatabaseusingBLASTprogram.2.TheprokaryoticexpressionoftargetedDNAmethyltransferaseB1-3a.ThevalidatedgenefragmentwasinsertedintopET32avector.ProteinexpressionwasinducedbyIPTGinBl21.Theexpressedproteinwasinsoluble.3.TheexpressionoftargetedDNAmethyltransferaseinPichiayeast.TookpcDNA4-B1-3a-Myc-6Hisplasmidkeptbyourlaboratoryasthetemplate,amplifiedtheDNAbyPCR,recoveredandpurifiedthePCRproductandinserteditintotheyeastexpressionvectorpPIC3.5kandsequenced.SequencesthusobtainedwerevalidatedtoGenBankdatabaseusingBLASTprogram.TheexpressedfusionproteinB1-3a-Myc-6Hiswasmainlyinsoluble.The-10- 第四军医大学硕士学位论文expressionfusionproteininsupernatantofyeastsplitproductwaspurifiedbyNi-NTAagarosebeadsaffinitychromatography.Theobtainedproteinwasanalyzedbypeptidemassfingerprint.4.InsertedtheDNArecognizabletozincfingerproteinintothefixed-pointoftheyeastgenometoconstructartificialtargetgene.TookpcDNA4-B1-3a-Myc-6Hisplasmidkeptbyourlaboratoryasthetemplateanddesigned3'endprimerstolinktheB1-3abindingsequencetothedownstreamofB1-3a-Myc-6HisthroughtwicePCRs,recoveredandpurifiedthePCRproductandinserteditintotheyeastexpressionvectorpPIC3.5kandsequenced.SequencesthusobtainedwerevalidatedtoGenBankdatabaseusingBLASTprogram.Integratedthetargetedgenesequenceintothefixed-pointoftheyeastgenomethroughhomologousrecombination.5.TheanalysisofthemethylationfunctionoftargetedDNAmethyltransferaseatyeastchromatinlevel.Extracttheinducedandnon-inducedyeastgenomescontainingB1-3a-Myc-6His-BSsequence,treatedthegenomicDNAbybisulfiteandtookthemasthetemplatesforPCR，recoveredandpurifiedthePCRproductsandinsertedthemintopMD19-Tvectorsandsequenced.SequencesthusobtainedwerevalidatedtoGenBankdatabaseusingBLASTprogram.Keywords:DNAmethyltransferase;PichiaYeast;AffinityChromatography;Specificity;DNAtargetedmethylation;GeneSilencing;EpigeneticModification;-11- 第四军医大学硕士学位论文前言自然科学的进展使人类对于疾病的认识和研究逐渐由整体水平发展到细胞和分子水平，特别是近年来涌现的新技术使人们从认识生理和病理状态下的分子水平的变化而逐渐引入人工分子对细胞功能状态进行干预。这将从分子的角度认识基因相关性疾病的发病机制以及对相关疾病的预防、诊断和治疗提供可行的方案。基因治疗的基础研究主要集中于可以对基因表达的特异靶向性调控因素的研究。通过对人工转录因子进行优化可以实现对靶基因进行特异性调控。锌指蛋白（Zincfingerprotein，ZFP）可以识别不同序列的DNA，C2H2结构域中氨基酸序列的多样性决定了ZFP所结合的基因组DNA序列的特异性。每个锌指都是由30个氨基酸残基组成，包含两个保守的半胱氨酸和两个保守的组氨酸。这些蛋白质已被用来作为新型转录因子的DNA结合结构域（ZFPtranscriptionfactors，ZFPTFs）。可以通过两种方式将ZFPTFs用于确定其靶标。一种是直接设计ZFPs的核苷酸序列用以确定其激活或抑制一个基因的表型变化。另一种是用ZFPTFs文库筛选所需表型突变的细胞。将人工设计的锌指蛋白同天然的转录激活因子或抑制因子的转录调控结构域相融合而构建的工程转录因子即可实现对靶基因的特异性调控。以往实验已经使用人工转录因子对三种保守的病毒启动子（SV40，CMV，RSV）实现了基因表达的调控。获得预期的基因表达的水平依赖于几个变量：不同DNA结合结构域对靶序列的亲和力，活性结构域的性质，所选用的细胞类型以及靶序列相对核心启动子的位置等。在特定的细胞类型中，针对特异的靶序列设计人工转录因子需要同时评估这-12- 第四军医大学硕士学位论文些因素以保证将基因的表达调节至最佳水平。哺乳动物细胞内的DNA甲基化酶是通过其N端的调节结构域与一些DNA结合蛋白（如转录因子）的直接或间接相互作用被募集到特定的DNA区域完成甲基化，例如，白血病癌性转录因子PML-RAR通过与从头甲基化酶DNMT3A调节区的相互作用将其募集到靶基因RARβ2的启动子区，引起启动子区DNA过甲基化并导致基因的沉默和促进细胞恶变。DNA甲基化通过启动细胞内基因沉默机制，使沉默起始信号得到放大和强化。鉴于DNA甲基化在体细胞内的可遗传性，靶向性DNA甲基化一旦建立便由细胞内的维持甲基化机制向子代体细胞稳定地传递，因而靶向性DNA甲基化对基因表达的沉默作用不需要靶向性甲基化酶的持续存在。本研究根据DNA甲基化可导致基因沉默的原理，通过构建重组靶向性DNA甲基化酶，建立靶向性DNA甲基化的技术平台，在转录水平实现特异性基因沉默。该技术平台的建立为疾病治疗的基因干预策略提供了一个新的选择。-13- 第四军医大学硕士学位论文文献回顾一、人工锌指蛋白的研究进展在基因治疗策略中，靶向性调控基因的表达具有非常重要的实用价值。致病基因的表达或细胞内某些基因的异常表达，是某些疾病发生发展的重要原因。选择性地关闭致病基因或异常表达的基因是解决上述问题的主要策略之一。目前用于基因干预的手段主要有如下几种：在转录水平有识别特定DNA序列的锌指融合转录抑制因子技术；在转录后水平有反义核酸技术、核酶技术，以及近年兴起的RNA干扰技术；在蛋白质水平有抗体封闭技术。本实验中，拟以人工锌指蛋白实现对靶基因的特异性调控。锌指蛋白是一类具有指状结构域的转录因子。根据半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）残基的数目和位置可将锌指蛋白分Cys2-His2、Cys2-His-Cys、Cys2-Cys2、Cys2-His-Cys-Cys2-Cys2、Cys2-Cys2-Cys2-Cys2等亚类。Cys2-His2锌指蛋白构成了真核生物转录因子的最大的家族，也是目前研究最为清楚的一类锌指蛋白。人类基因组的转录激活因子中将近半数属于该家族。因此，锌指为设计和构建各种人工转录因子提供了一个良好的框架。人工转录因子中，作为DNA结合结构域的替代性锌指可以直接识别内源性靶序列，因此避免了构建靶DNA（例如，不需再设计特异的靶序列，如四环素操纵子或Gal4结合序列等）的操作。人工设计的具有识别靶DNA序列的锌指已被成功用于调节内源性染色体基因。目前有关人工转录因子的应用研究主要集中在人类疾病的治疗、新药物发现和生产、农业生物技术及基因功能的研究等方面。本文拟扼要介绍有关人工锌指的研究现状。-14- 第四军医大学硕士学位论文1.锌指蛋白的结构特征：Cys2-His2锌指结构由1个α-螺旋和2个反平行的β-折叠三个2+肽段组成。通过结合锌离子（Zn）来稳定一种很短的可自我折叠成“手指”的多肽空间构型。此结构的N-端有1对半胱氨酸残基，C端有一对组氨酸残基，此4个残基在空间上形成一个空穴，恰2+2+好容纳一个Zn。由于Zn可稳固锌指的α-螺旋结构，致使α-螺旋能镶嵌于DNA的大沟中，因此含锌指结构的蛋白质都能与[1]DNA或RNA结合。Cys2-His2锌指单元结构如图1所示：图1：Cys2-His2锌指单元结构2．人工锌指的设计和功能性研究设计可以识别任何已知DNA序列的蛋白质是分子生物学的一个重要目标。这些蛋白可以运用于多种用途，其中最重要的一个是调控基因表达。几个致力于锌指基序的科研小组已开发出噬菌体展示策略用于分离嵌合于Zif268蛋白的DNA结合区域中的[2-5]可识别三核苷酸的组件。其它研究结果显示，这些经噬菌体-筛选所获得的锌指能够通过组合成多聚体而识别较长的DNA序列（10bp），进而设计并表达出了可以下调小鼠细胞的一个癌基因-15- 第四军医大学硕士学位论文[6]表达的蛋白质。继而通过对该基序同DNA识别的基础机制的研究，大大推动了人工锌指领域的发展。构建具有相对较长的DNA[7,8]识别区域的锌指多聚体可以增强其同靶基因结合的特异性。许多研究中使用锌指转录因子调控基因的表达。将效应因子同锌指蛋白相结合构建具有调控基因表达作用的嵌合酶是分子生物学研[9]究领域中的一个热点，这些效应因子包括限制性内切酶、整合酶[10][11]、DNA甲基化酶等。2.1锌指蛋白的筛选和构建一个理想的人工转录因子必须可以特异性地识别其靶序列。细胞中存在大量的基因调控位点，如果人工转录因子的特异性不好，就有可能作用于非目的基因，影响它们的转录。如前所述，人工转录因子的序列特异性是靠其DNA结合结构域（最常用的是锌指结构）来实现的，因此，获得特异识别DNA序列的锌指蛋白是构建人工转录因子时最重要的步骤。2.1.1文库筛选最初，人们通过分析已知锌指蛋白中α螺旋的关键氨基酸位点，以及这些氨基酸位点所识别的碱基而得到一个对应的表格。这种表格有一点类似于密码表，利用这个表格可以得知当DNA序列中出现某个碱基的时候，相应锌指的关键氨基酸位点通常应该是哪些氨基酸。于是，根据这种表格可以人工设计针对某个特定[12]序列的锌指。可是，后来人们发现这种方法在某种程度上并不非常可靠。目前设计所得到的特异性最好的三锌指蛋白只能可以特异地识别9bp靶序列中的7个碱基位点，远未达到实际应用的[13]要求。于是，人们更加倾向于使用从文库中筛选的方法来得到-16- 第四军医大学硕士学位论文能够特异识别自己感兴趣的DNA序列的锌指结构。这样的锌指文库目前有噬菌体展示系统、酵母单杂交系统、细菌双杂交系统以及哺乳动物细胞筛选系统等多种。2.1.1.1噬菌体展示策略：噬菌体展示系统在许多蛋白与多肽的研究中都已经成为一种强有力的手段；在人工锌指蛋白的筛选方面，由于筛选中利用DNA片段来富集文库中能够特异结合该DNA片段的锌指蛋白，因此与常见的抗体筛选略有不同。最初，B．A．Christy等为了探讨噬菌体展示技术应用在DNA与锌指作用的研究领域的可行性，将Zif268的三锌指结构表达在丝状噬菌体的表面，从而构建了最早的可以在表面展示锌指结构的噬菌体[14]展示载体。目前常见的噬菌体展示锌指文库都是以Zif268的三锌指结构做为基本骨架而构建的，由于转化效率所造成的库容的限制，在一个文库中最多只能把一个锌指单元中的α螺旋的几个[2,4]关键氨基酸位点完全随机化。因此，每次只能筛选到识别3～4bp．DNA的一个锌指单元，然后再把这些锌指单元串联组合成可以识别比较长的DNA片段的多指串联体。利用噬菌体展示技术筛选具有新的DNA特异性的锌指的策略最常见的有以下三种：“平行筛选”（Paralleselection，如图2a）、“顺序筛选”（Sequentialselection，如图2b）以及“两部分筛选”[15-17]（Bipartiteselection，如图2c）。三种策略都是以Zit268中的三锌指结构（在下文中将其三个锌指单元简称为Fl、F2与F3）作为骨架，区别在于在文库构建中选取了不同的随机化部位，并在筛选中采用了不同的策略。图2假设已知一段我们感兴趣的9bpDNA序列，分别展示利用三种策略筛选到与这个9bp靶序列特异-17- 第四军医大学硕士学位论文结合的三锌指结构的过程，图中长方形表示筛选所采用的DNA片段。克隆新文库剪接克隆剪接新文库图2：识别特异序列的锌指蛋白的筛选策略“平行筛选”策略（图2a）是将Zif268第二指（F2）的α螺旋关键氨基酸位点随机化，第一指（F1）与第三指（F3）沿用Zif268的序列，构建噬菌体展示文库。在筛选的时候，Fl与F3起锚定作用，筛选的靶序列设计在F2对应的位置（图2a中星号部分）。因此，每一次筛选都可以得到特异识别图2a星号部分所示3bp序列的锌指单元。三次筛选之后，将每次筛选所得的锌指单元串联起来，就得到了能够特异识别9bp靶序列的锌指结构。“平行筛选”策略的前提是，每个锌指单元都独立识别靶序列，彼此之间互不-18- 第四军医大学硕士学位论文干扰，因此其最大的优点就是操作简便。但是实际上在锌指结构识别DNA序列的时候，相邻的锌指单元之间存在协同作用（见图lb）。实际上，该策略构建的文库的F2只能识别5'-GNN-3'或者[2,4,14]5'-ANN-3'。这大大地限制了这种策略的应用范围。“顺序筛选”策略（图2b）是针对平行筛选的这种缺陷而提出的。该策略首先将Zif268第三指（F3）的α螺旋关键氨基酸位点随机化，第一指（F1）与第二指（F2）沿用Zif268的序列，构建噬菌体展示文库。利用该文库筛选到与特定DNA序列（图2b中星号部分）相作用的锌指后，再构建新的噬菌体展示文库，用上一轮筛选中的F2作为新的F1，筛选到的锌指作为新的F2，在其端部加入新的随机化锌指F3，再进行筛选。这样，第一步筛选随机化端部的一个锌指，然后每进行一步筛选都要把上一轮筛选得到的锌指作为骨架构建新的文库。显然这种策略充分考虑到了相邻锌指之间的协同作用，但是在筛选的过程中需要不断地构建新[18]的文库，比较耗时耗力。“两部分筛选”（图2c）结合了前边两种筛选方法的优点：在Zif268的第二指（F2）中引入一个DdeI酶切位点，将Zif268分成两部分，分别随机化前后各一个半锌指构建文库。两个文库分别针对5bp靶序列进行筛选（图2c中星号部分），然后通过一些简单的重组与筛选步骤，最终得到特异地结合9bp目的靶序列的锌[19]指结构。这是目前用于锌指筛选的最好的噬菌体展示策略，它不仅考虑了锌指靶序列的重叠以及锌指之间的协同作用，与“顺序筛选”策略相比也大大缩短了文库构建与筛选的时间，结合96孔[20]或384孔板以及机械手可以实现高通量的筛选。-19- 第四军医大学硕士学位论文2.1.1.2其它策略：即使是“两部分筛选”策略，仍需要经过好几轮的筛选才能得到序列特异的锌指；于是后来又发展出其它的[21][22]锌指筛选策略，包括酵母单杂交系统，细菌双杂交系统和哺[23]乳动物细胞筛选系统。这些系统的优点在于它们都是在活的细胞中筛选锌指，因此筛选条件更加接近于正常的生理环境（如染色质结构、DNA修饰、其它的细胞或组织特异性因子的存在等），并且特异作用于靶DNA的锌指蛋白经过一轮筛选就可以得到。2.2工程锌指的人工设计包括Zif268和Sp1在内的锌指蛋白的一个亚家族可通过非常简单的相互作用而结合富含鸟嘌呤/胞嘧啶的DNA。许多研究致力于通过定点突变和噬菌体展示技术而将锌指识别的DNA亚位点扩展至四种碱基，进而实现可结合某段DNA序列的锌指的人工设计。识别DNA序列的相关密码子不是绝对的。已有实验实现了可特异结合任意DNA序列的锌指蛋白的人工设计。2.3可识别长DNA序列的锌指蛋白的构建为了保证对基因表达调控的特异性，人工锌指应当仅针对特9定的靶序列起作用。由于人的基因组大约含有3×10bp，因此通17常l7bp（4种可能的组合方式）或者更长的序列才可能保证其在人类基因组中只有单个拷贝。由于每个锌指单元通常识别3bp的序列，所以人工转录因子的DNA结合结构域应该有六个或者更多的锌指单元组成。由于目前通过文库筛选得到的大多是三锌指结构，于是常常需要把多个锌指单元通过接头串联起来。实现这个目的的方法有两种，一是利用在天然的多锌指蛋白中常见的连接[24]肽或者人工设计的更长的连接区把多个锌指串联起来；二是将-20- 第四军医大学硕士学位论文两个三锌指结构分别与二聚化区域融合，令其发生二聚化而形成[25]六指结构。常用的二聚化结构域包括Gal4的二聚化结构域以及[17]亮氨酸拉链。2.4用锌指转录因子调控基因一般情况下，有三种方法使用锌指基因开关干预基因的表达。[26]（1）过表达锌指DNA结合结构域来阻断目的基因的转录。（2）通过与基因启动子的结合来抑制转录，该方法主要是通过占位而抑制其它转录因子的结合。（3）将转录调控结构域同锌指DNA结[27-30]合结构域相融合，构建人工转录因子。大体而言，在基因开关中，最有优势的是自然界中最常用的那种类型，即含效应因子结构域的转录因子。这些锌指蛋白一般都是非常可靠、高效的基因表达调控因子，依据效应因子结构域的不同可发挥促进因子或抑制因子的作用。此外，锌指不一定靶向作用于一个启动子或基因的特定区域，也可以设计结合启动子附近的DNA序列。基因调控实验主要是将含有不同数量的锌指结合区域和人工启动子的报告基因载体和不同剂量的表达锌指转录因子的质粒瞬[7,26-28,31-34]时共转染。接下来的实验将包括使用整合报告载体或内源性基因，以及使用更有实际应用价值的表达锌指蛋白的方法。在某一研究中，使用锌指和抑制结构域相融合而构建的转录因子在一个肿瘤细胞系中导致了癌基因erbB2/3的沉默。该实验使用病毒表达载体表达锌指蛋白转录因子，并用四环素可诱导系统控制转录因子的表达量。3.人工锌指的应用前景-21- 第四军医大学硕士学位论文除调控基因表达外，DNA结合蛋白在DNA限制和修饰、DNA重组、DNA整合和诸多其它功能中也发挥着重要的作用。因为这些蛋白包括DNA结合结构域和效应因子结构域，所以有望使用这些锌指嵌合体实现对DNA进行进一步的操作。最佳的一个例子就[9,35,36]是将锌指与不同的核酸内切酶结构域相融合，在体外和体内[37][10]对DNA进行剪切。锌指还同HIV来源的整合酶结构域和甲[11]基化酶M.SssI构建融合蛋白。此外，现已设计出可选择性地特异结合甲基化DNA的锌指蛋白，且该甲基化既可以是天然的甲基[38]化酶诱导的，也可以是嵌合锌指甲基化酶诱导的。因此，有望通过构建含锌指结构的可相互独立结合DNA的蛋白实现对基因表达的调控和对DNA直接进行操作。二、DNA甲基化研究进展表观遗传学（Epigenetics）是1942年由WaddingtonCH提出的。表观遗传是指不因DNA序列的变化而形成的基因功能的改变，这种改变又可随细胞的有丝分裂和（或）减数分裂遗传下去的现象。主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控4种方式来控制表观遗传的沉默。表观遗传学有如下三层含义:（1）可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传;（2）是基因表达的改变;（3）没有DNA序列的变化或不能用序列变化来解释。表观遗传学不仅对基因表达、调控、遗传有重要作用，而且在肿瘤、免疫等许多疾病的发生和防治中亦具有十分重要的意义。它和DNA的改变所不同的是，许多表观遗传的改变是可逆的，[39-41]这就为疾病的治疗提供了乐观的前景。本文拟扼要介绍有关-22- 第四军医大学硕士学位论文DNA甲基化的研究现状。1.DNA甲基化的基本概念在高等真核生物，DNA甲基化是发生在胞嘧啶环第五位碳原子上的甲基化修饰；该修饰几乎都发生在CpG双核苷酸（在植物还可以发生在CpNpG中的C）。DNA甲基化并不改变DNA原有的碱基配对特性和遗传信息，但给DNA增加新的信息。DNA甲基化在高等生物的发育、基因表达模式的维持以及基因组的稳定[42]性中都起着十分关键的作用。2.DNA甲基化的分子机理和功能DNA甲基化修饰是由酶促反应完成的，按照过程和功能分为从头甲基化和维持甲基化。在哺乳动物中，目前鉴定的主要从头甲基化酶有Dnmt3a和Dnmt3b，维持甲基化酶为Dnmt1。从头甲基化酶主要负责向DNA上引入新的甲基化，对底物DNA没有[43,44]选择性；维持甲基化酶Dnmt1对底物DNA有选择性，它优先识别和催化半甲基化（hemimethylated）DNA，因而它的功能主要[45]是在DNA复制后将母链的甲基化模式忠实地拷贝到新生链上，这也是DNA甲基化这种表观遗传信息在体细胞得以遗传的分子基础。从头甲基化则保证了甲基化的动态性以及对环境的适应性。2.1Dnmt1的结构及同源性1988年首次通过生化分馏法分离出鼠的Dnmt1，1992年鉴别出人类的Dnmt1，并定位在人染色体的19p13.2上，鼠和人的Dnmt1有78%的同源性。体外实验表明，Dnmt1与半甲基化DNA底物结[46]合的容易度是完全未甲基化DNA的5～30倍。Dnmt1由1620个氨基酸组成，C末端为酶反应区域，属于相对保守区；N末端-23- 第四军医大学硕士学位论文是酶的调节区域，该区域与Dnmt1在胞浆与胞核间的转移、细胞周期S期时Dnmt1与DNA复制叉的结合，以及部分抑制新发甲基化的发生等有关。在人和小鼠胚胎中，Dnmt1存在两种异构体：一种是体细胞型的Dnmt1s，约190kD，在胚胎干细胞和体细胞组织中都有表达，翻译起始于exon1的ATG3；另一种是卵母细胞特异性的Dnmt1o，约170kD，合成于卵母细胞生长、成熟和胚胎植[47]入前发育的过程中，翻译起始于exon4的ATG4，其N末端比Dnmt1s要少118个氨基酸。2.2Dnmt3的结构及同源性1998年有学者通过表达序列标签（EST）数据库分析研究鉴定出人的DNMT3a基因定位于2p23上，并发现人和小鼠DNMT3a的氨基酸有96%的同源性；1999年绘制出人类的DNMT3b基[48]因图，位于20号染色体q11.2，与小鼠有85%的同源性。小鼠Dnmt3a和Dnmt3bcDNA长度分别是4192bp和4195bp，所编码的蛋白质是908和859个氨基酸，两者C末端的酶催化区有80%的同源性，而N末端的功能区仅有30%的同源性，提示Dnmt3a和Dnmt3b具有不同的功能。Dnmt3b基因至少包含24个外显子，可通过选择性剪切外显子10、21和/或22编码多种产物，分别在人类和小鼠中产生5种和8种异构体。不同亚型之间具有不同的DNA靶向位点，在胚胎发育中发挥着不同的功能。Dnmt3b1和Dnmt3b2蛋白的P-C模序中的半胱氨酸是胞嘧啶甲基化酶的催化位点，如果该半胱氨酸被丝氨酸替代，Dnmt3b1和Dnmt3b2就失去酶活性。Dnmt3b3、Dnmt3b4和Dnmt3b5蛋白的C末端因缺乏模序IX或X而不具有酶催化活性，但可以通过-24- 第四军医大学硕士学位论文与Dnmt3b1-2结合的靶蛋白相互作用后，抑制它们的从头甲基化[49]作用。早期胚胎中发挥作用的主要是Dnmt3b1，分子量为120kD，其编码基因包含所有的外显子。2.3DNA甲基化与基因沉默高等生物的DNA甲基化一般发生在CpG二联体上，在Dnmt的作用下，CpG二联体的胞嘧啶环5'位的氢被S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代，从而变成5'-甲基胞嘧啶。真核生物存在两种甲基化酶：一种是维持DNA甲基化酶即Dnmt1，主要在模板链的指导下使处于半甲基化DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化；另一种是重新DNA甲基化酶，即Dnmt3a和Dnmt3b，它可在未甲基化的DNA双链上进行甲基化，不需要母链的指导。通过基因敲除证明Dnmt1和Dnmt3b对于胚胎发育是必需的，缺乏Dnmt3a的小鼠将在出生后几周内死亡。发生在基因启动子或其附近区域的DNA甲基化将直接阻碍转录因子如AP22、c2MycPMyn、CREB、E2F和NF2κB与启动子结合，从而使基因不能转录或转录水平降低。大量的研究表明，DNA的甲基化和基因的失活紧密相关。一般情况下，基因启动子区的甲基化导致基因表达的关闭，或称为沉默。目前认为其机理主要是：（1）结合在甲基化的DNA上的甲基胞嘧啶结合蛋白复合物（methyl-cytosinebindingproteincomplexes，MBDs）募集辅抑制物（co-repressor）如mSin3或mi-2及其它染色质修饰和重构因子，如组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases，HDACs）、组蛋白甲基化酶（Histonemethyltransferases，HMT）等，通过对组蛋白进行修饰改变染色-25- 第四军医大学硕士学位论文质结构，并募集染色质结构因子如HP-1（Heterochromatinprotein1）[50]等，最终形成稳定、致密型的异染色质样结构；该结构将启动子等调节序列包埋起来，使转录机制无法靠近并与对应序列结合，从而导致基因表达的彻底关闭；2）某些转录因子结合区的甲基化直接干扰了转录因子的结合，从而抑制基因的转录。2.4DNA甲基化的生物学作用2.4.1DNA甲基化与遗传印记、胚胎发育DNA甲基化在维持正常细胞功能、胚胎发育过程、遗传印记中起着重要作用。自受精卵形成的第3～4天起，维持DNA甲基化的DNMT1完全失活，致胚胎干细胞中DNA完全去甲基化，随后再由DNMT3a、DNMT3b催化重建基因组的甲基化，使细胞正常分化和发育。而缺少任何一种甲基化酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的。由此可见，胚胎的正常发育得益于基因组DNA适时的甲基化;在基因印记方面，目前认为DNA甲基化是引起基因印记的主要原因。基因印记通过某种机制，特异地抑制父源或母源一方等位基因的表达，仅使另一方(母源或父源)等位基因进行表达。由于基因印记形成于胚胎发育早期，因此胚胎早期异常的DNA甲[51]基化将造成印记丢失，导致某些肿瘤的发生。Steenman等(1994年)研究发现Wilms’瘤患者H19基因上游的CpG岛发生双等位基因甲基化(正常仅父源等位基因发生甲基化)造成印记丢失，使H19基因不表达，H19上游的IGF2基因过表达，致肿瘤形成。异常的印记基因还与多种人类表型缺陷疾病有关，如：脐疝-巨舌-巨大发育综合征(Beckwith-Wiedemannsyndrome，BWS)和Prader-Willi/Angelman综合征等。-26- 第四军医大学硕士学位论文2.4.2DNA甲基化与肿瘤甲基化状态的变化是引起肿瘤的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定，如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达和抑癌基因的失活。抑癌基因是目前肿瘤甲基化研究的主要热点，这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区CpG岛甲基化造成抑癌基因的关闭有关。Yang等在9种抑癌基因的研究中发现，肝癌中抑癌基因启动子区呈现高甲基化状态，常发生甲基化的抑癌基因有socs21(65%)、gstp(54%)、apc(53%)、E2cadherin(49%)和p15(49%)，且socs21、gstp、p15基因的甲基化发生频率在肝细[52]胞癌中较肝硬化中更高。Toyooka等描述了肿瘤发生与异常甲基化的关系：被SV40感染的人间皮细胞，其端粒酶活性上调，Notch-1基因表达增加，肿瘤相关基因(包括抑癌基因rassf1a)的启动子区发生异常甲基化，肿瘤发生。由于DNA甲基化是肿瘤发生的早期事件，CpG岛局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的研究对肿瘤的早期诊断具有重要意义。除抑癌基因外，Soares等在乳腺癌的研究中还发现全基因组的低甲基化也随肿瘤的发生而出现，并随肿瘤恶性度的增加而显著。DNMT1在成体细胞中起维持甲基化的作用，是维持基因组甲基化的关键酶，当与无活性的p53结合后表达下降，而肿瘤细胞中常存在高水平无活性的p53。因此推测，全基因组的低甲基化状[53]态可能与DNMT1低表达有关。Uhlmann等发现在不同恶性程度的神经胶质瘤细胞中，其7种肿瘤标志基因的甲基化程度亦不-27- 第四军医大学硕士学位论文同。由此可见，甲基化的研究，为肿瘤的早期诊断和恶性度分级提供了一定的依据。2.4.3甲基化与衰老细胞衰老过程中，基因组的总体甲基化水平降低。反之，采用DNA甲基化抑制剂处理体外培养细胞，细胞寿命则明显缩短，出现早老表型。因细胞基因组含大量DNA重复序列，如微卫星DNA，散在的长序列重复元件（LINE-1），反转录源性元件以及内[54]源性反转座子等。正常情况下处于高度甲基化状态，因此一旦发生去甲基化，基因组的稳定性降低，对于肿瘤的发生和发展具有促进作用。细胞衰老过程中，除总体甲基化水平降低外，也存在基因特异的甲基化降低。如CD11a、c-Myc、β肌动蛋白基因等[55]，除CD11a外其它基因的去甲基化位点通常不在启动子序列，且具有组织特异性。因此,去甲基化对于这些基因表达造成的直接影响还有待进一步探讨。然而，衰老细胞在基因组DNA甲基化降低的同时，也存在某些特异性基因的高甲基化。抑癌基因ER是第一个被鉴定有此特性的基因，在年轻人的直、结肠组织细胞，ER基因启动子部位CpG岛的甲基化几乎检测不到，以后随增龄直、结肠组织细胞的甲基化程度逐渐增加，同时转录水平逐渐降低，并最终导致基因沉默。另外，启动子部位甲基化随细胞衰老增加的还有E-cadherin、myoD、N33等。3.靶向性DNA甲基化:一种新的特异性基因沉默策略DNA甲基化引起基因沉默的特性提示：选择性地关闭基因的表达可以通过靶向性甲基化来实现，即将DNA甲基化修饰特异性-28- 第四军医大学硕士学位论文地引向靶基因的启动子或基因表达调节区。DNA甲基化通过启动细胞内基因沉默机制，使得起始的沉默信号得到放大和强化。鉴于DNA甲基化在体细胞内的可遗传性，靶向性DNA甲基化一旦建立便利用细胞内的维持甲基化机制向子代体细胞稳定地传递，因而靶向性DNA甲基化对基因表达的沉默作用不需要靶向性甲基化酶的持续存在。目前比较成熟的基因抑制手段如反义核酸、核酶、RNAi和单克隆抗体等技术，其对靶基因的抑制作用都需要效应因子的持续存在，而这些效应因子一旦撤除，基因表达又将重新恢复；而长期维持效应因子的表达在技术上具有一定的挑战性，目前尚无有效解决该问题的方法。此外，靶向性甲基化策略是一种主动干预策略，在转录水平将基因沉默，是关闭“源头”，而不是被动地抑制或对抗基因的表达产物。在真核细胞中，已经使用嵌合靶向性[56]DNA甲基化酶实现了对瞬时转染表达的靶基因的沉默。4.靶向性DNA甲基化的分子基础哺乳动物DNA甲基化酶的鉴定与功能阐明为构建用于基因沉默的靶向性甲基化酶提供了较为理想的分子基础。哺乳动物DNA甲基化酶是由N端调节结构域和C端催化结构域组成。Dnmt1催化结构域的活性依赖于与N端结构域的相互作用，单独则无活性；我们的研究证实，从头甲基化酶Dnmt3a和3b的催化结构域的酶促活性不依赖于N端调节结构域，即单独表达的催化结构域也有催化活性。与原核甲基化酶相比，选择人或鼠的DNA从头甲基化酶有下述优点：1、人（鼠）DNA从头甲基化酶独立的催化结构域也具有相当的活性，而且除了CpG外无序列特异性，-29- 第四军医大学硕士学位论文这为改造和构建具有新的序列特异性DNA甲基化酶提供了条件；2、原核生物的甲基化酶对DNA的甲基化是进行性的，即酶沿DNA链滑动，甲基化同一条链上所有可被甲基化的位点，因而对DNA的甲基化是全和无的关系；而人（鼠）从头甲基化酶的催化过程则不是进行性的，因而更具有可调控性；3、人（鼠）DNA从头甲基化酶的天然底物是染色质结构中的DNA，因而适合用于体内靶向性甲基化。上述优点为设计和构建具有新序列特异性的甲基化酶提供了更为理想的分子基础。5.靶向性DNA甲基化的应用前景作为一种新的特异性基因沉默手段，靶向性甲基化对基础研究和对临床治疗都将具有重要的应用价值。除了作为特异性基因沉默的策略之外，靶向性DNA甲基化还可以用来纠正一些区域性的甲基化缺失，如印迹丢失，为表观遗传疾病的治疗提供一种全新的策略。三、DNA甲基化的研究方法进展：CpG甲基化作用已成为阐明正常和病理基因表达现象的重要机制，因而成为当前分子生物学的研究热点之一，近年来，DNA甲基化检测技术有了很大的发展和完善。本文拟扼要介绍有关检测DNA甲基化的检测方法。1.基因组整体水平甲基化分析1.1高效液相色谱法：Kuo等（1980）首次将高效液相色谱（HPLC）用于定量测定基因组整体甲基化水平。具体方法如下：将DNA样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果同标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算5mC/（5mC+5C）-30- 第四军医大学硕士学位论文[57]的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Fraga等运用高效毛细管电泳法（HPCE）处理DNA水解产物确定5mC的水平，相比HPLC，HPCE更简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定基因组整体DNA甲基化水平的敏感性均较高。Oefner等（1992年）提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA分子。邓大君等将其改进并与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法，将重亚硫酸盐处理产物进行差异性扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理被保留，因此在随后的PCR扩增时，其变性稳定也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测出PCR产物中甲基化的情况。这些方法最明显的优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的基因整体甲基化的水平，但不能定位具体的甲基化位点。1.2SssI甲基转移酶法：SssI甲基转移酶是一种能催化3DNACpG位点从头甲基化(denovomethylation)的酶。H-S-腺苷甲3硫氨酸(H-SAM)在SssI甲基转移酶的催化下,其所含的甲基转移至基因组DNA的CpG位点的非甲基化的胞嘧啶上,通过测量3[58]未参加反应的H-SAM的量来检测基因组DNA甲基化水平。具3有放射性的H-SAM剩余越多,则基因组DNA的CpG位点甲基化水平越低。由于SAM和SssI甲基转移酶性质不稳定,易造成重复操作的同一实验结果误差大,必须设立自身对照来标化实验数据。而且DNA溶解是否均一也影响了DNA浓度的测定,解决的较好方法是在测定DNA浓度之前,先用识别位点不含CpG序列的限制性-31- 第四军医大学硕士学位论文内切酶消化待测DNA,再用酚:氯仿抽提。这是较经典的方法,但需注意操作过程中的同位素防护。1.3氯乙醛反应法：氯乙醛反应是一种检测DNA甲基化水平[59]的荧光分析法。该法的基本原理是：经硫酸处理过的基因组DNA被纯化后,先用银或柱色谱去除DNA链上的嘌呤,再用亚硫酸处理,致使未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受影响,最后将处理后的DNA样品与氯乙醛温育,结果导致甲基化的胞嘧啶转变成具有很强荧光性的乙烯胞嘧啶。荧光的强度与DNA甲基化水平成正比例。其中的嘌呤的去除对检测的成功极为关键。该方法可检测任何DNA序列的甲基化水平。因氯乙醛和DNA自身都没有荧光,所以不要求大量的下游纯化,但此法较费时,且氯乙醛为剧毒物质。1.4免疫学法：免疫学法是利用单克隆抗体能特异性结合甲基化的胞嘧啶的特点。该法的基本原理：用异硫氰酸荧光素标记单克隆抗体,再将其与已固定在DEAE薄膜上的DNA样品共温育,通过测定DEAE薄膜上荧光素的强度就可知DNA甲基化水平。荧光素的强度与DNA甲基化水平成正比例。本方法高度特异性和敏感性的关键是抗体的设计。该法的主要限制是它只能在甲基化的胞嘧啶处于非碱基对状态下才能定量检测,而在浓缩染色体上很难存在这种状态。2.位点特异性DNA甲基化的检测方法2.1甲基化特异性PCR法（MSP）：Herman等(1996年)在重亚硫酸盐处理的基础上提出了甲基化特异性的PCR(methylation-specificPCR,MS-PCR)，它将DNA先用重亚硫酸盐-32- 第四军医大学硕士学位论文处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变,随后行引物特异性的PCR。此法的核心是引物设计,要求:①设计引物末端达检测位点结束;②两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对,即一对引物用于结合处理后的甲基化DNA链,另一对则用于结合处理后的非甲基化DNA链。过程：设计好的特异性引物与含有一个或多个CpG位点的待测序列结合,若待测序列为完全甲基化,则用针对甲基化DNA链的引物能扩增出片段;若为完全非甲基化,则用针对非甲基化DNA链的引物能扩增出片段,由此明确待测序列中CpG位点是否存在甲基化。这种方法的优点是:①避免了使用限制性内切酶及相关问题；[60]②敏感性高；可用于石蜡包埋样本。缺点是：①引物设计要求高,可靠的MS-PCR引物需设计包含2个或多个完全甲基化或非甲基化CpG位点,由此限制了MS-PCR的使用；②这种方法只能作定性研究,即只能明确是否存在甲基化;不能作定量检测；③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。2.2甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/SouthernBlot法：甲基化敏感的限制性内切酶(methylation-sensitiverestrictionendonucleases，MSREs)是一类对其识别位点含有甲基化碱性敏感的限制性内切酶,目前至少已发现320种。此类酶如在其切割位点中含有1个甲基化碱基,则它们中的绝大多数就不能切割DNA,此外它们一般不能区分5-甲基胞嘧啶、4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或糖化5-羟甲基胞嘧啶等。基于此原理的方法最常[61]用的就是SouthernBlot法。在此方法中用两种限制性内切消化酶切DNA,如HpaⅡ和Msp,Ⅰ这两种酶分别对甲基化敏感和不-33- 第四军医大学硕士学位论文敏感,但识别的DNA序列一致。此法的最大优点是无须知道靶DNA一级结构的详细信息,并可提供CpG岛甲基化状态的直接评价包括取得一些对被检基因甲基化的定量分析。SouthernBlot法虽然仍是甲基化分析的金标准,但此法也有许多缺点:①需要的DNA量较大,每个样本需要5～10μgDNA,若肿瘤标本DNA量少如石蜡包埋组织,则不能用这种方法,另外还只能检测单拷贝数比例大于百分之几的甲基化等位基因;②方法操作步骤较为繁琐,所需时间较长;③酶的不完全消化对可导致结果难以解释;④该法只能用于检测限制性内切酶识别位点处的甲基化状态。最近Pogribny等在MSREs法基础上建立了一种更为灵敏的甲基化分子新方法。它是基于DNA经MSREs(如HpaⅡ，AciⅠ和BssH)Ⅱ切割后,留下5'-G突出,随33后用H-dCTP进行单核苷酸延伸。这样鸟嘌呤的H掺入程度与未甲基化的(已切割的)CpG位点呈正相关。此法具有放射性标记不依赖于完整的DNA及甲基化检测不需要PCR扩增或DNA甲基化酶反应等优点,且方法灵敏,可以检测纳克级DNA。上述MSREs法及其改进方法常用于基因或染色体的印迹分析、抑癌基因异常甲基化以及某些遗传疾病的诊断中。2.3直接测序法：直接测序是由Frommer等(1992年)提出的研究DNA甲基化的方法。过程是:重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,用不含任何CpG位点的引物行PCR扩增,以免扩增时区别甲基化或非甲基化DNA。扩增后尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,根据缺失条带判断CpG位-34- 第四军医大学硕士学位论文点是否发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度均很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但需要大量的克隆测序,操作过程繁琐且费用昂贵。2.4结合重亚硫酸盐限制性分析法(COBRA)：此法类似于MSP策略,也可对任何DNA标本中特定位点的甲基化进行快速定量。-检测时,首先用HSO3处理待检测DNA,转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶。接着进行PCR扩增,引物设计在原序列中不含CpG位点但含有胞嘧啶残基的序列。然后纯化PCR产物,限制酶酶切,聚丙烯胺凝胶电泳分离,最后杂交检测。所使用的限制性内切酶要求它的识别序列中只有CG位点含C,比如BstUⅠ(CGCG)或TapⅠ(TCGA)。若其识别序列中的胞嘧啶被甲基化,则酶仍然能切割DNA[13]。故原始DNA甲基化水平可通过酶切的未酶切的PCR产物的相对数量来表示。本法是一种快速、灵敏的甲基化定量检测方法,且不受DNA甲基化水平范围的限制,但其定量信息的准确性取决于亚硫酸盐处理DNA样本是否完全,且甲基化分析也受限于限制性内切酶的酶切位点。2002年,Akey等在COBRA的基础上结合溶解曲线分析,建立一种叫McCOBRA的方法,它能简便、快速检测出待测样品中特定CpG位点的DNA甲基化的百分比例。设计McCOBRA分析时,需注意以下问题:①最好避免引物中含有CpG二核苷酸。②酶切片段和未酶切片段的Tm值至少有3℃的差别。2.5甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法：甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法能检测任何序列特定咆嘧啶的甲基化状态,且不需-35- 第四军医大学硕士学位论文[62]要克隆和测序PCR产物。本法的基本原理是：DNA经亚硫酸氢钠处理后,用链特异性引物(strand-specificprimer)对其进行PCR扩增,扩增反应会在待检测甲基化位点的前一个核苷酸处终止,然后用凝胶电泳纯PCR产物,纯化后的DNA片段分别与已放射性的dCTP在延伸反应中掺入,则证明此待测位点已发生甲基化了,如果有dTTP在延伸反应中掺入,则证明此待测位点未发生甲基化。对dCTP和dTTP的掺入量进行测定后,即可分析出该位点的甲基化状态。此法具有高度敏感性和特异性,只需要少量的DNA样本。由于较难成功地设计出缺乏CpG二核苷酸的引物,PCR误差和对富含Cp的区域的分析将成为一个难题。[63]El-Maarri等将SNuPE联合离子反相高效液相色谱技术,基于引物延伸产物的不同质量和疏水性,可以分辩和定量DNA的CpG位点甲基化状况。这种方法能在一个反应中同时快速检测多个位点,且不必克隆和测序经亚硫酸盐处理后的PCR产物。[64]2.6DNA芯片法：2001年Yan等将以分子杂交为基础的微阵列技术应用到DNA甲基化检测中,极大的提高了检测的效率。DNA微阵列,又称DNA芯片或基因芯片。这种基于杂交的寡聚核苷酸微阵列是为了在基因组范围内检测DNA变异而涌现出来的一种新型技术。主要有整个基因组范围内扫描的差异甲基化杂交(DMH)及针对某个基因检测的甲基化特异性微阵列(MSO)等。Adorjan等在此基础上对探针设计做了一些改进,他们所设计的探针只包含一个CpG位点,并采用这个方法检测了p15、p16、hMLHⅠ等大量基因。该微阵虽然能确定甲基化模式,但只是针对单个的CpG位点,只能检测抑癌基因启动子区很限的几个CpG位-36- 第四军医大学硕士学位论文点,对于抑癌基因CpG位点密集区的甲基化研究意义并不是太大。2.7结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)由Xiong和Peter于1997年首先报道,这种方法先对样本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增,处理后原甲基化的胞嘧啶被保留,而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶,随后用限制性内切酶BstUⅠ(CGCG)对PCR产物切割的特性识别原样本DNA的甲基化状况。例如:若待测样本序列中含有5mCG5mCG，则PCR扩增后保留为CGCG，BstUⅠ能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化,则PCR后转变为TGTG,BstUⅠ识别位点丢失,不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得[65]出原样本中甲基化的比例。Brena等联用COBRA和Agilent2100Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析，使COBRA的定量更快速、准确且无放射性污染。这种方法的优点有:①方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列；②可进行甲基化水平的定量研究；③需要样本量少,可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是：①只能获得特殊酶切位点甲基化情况,因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的[66][66]可能；②由于酶和PCR的使用,序列分析受到限制。2.8甲基化敏感性单链构象分析：甲基化敏感性单链构象分析(methylation-specificsingle-strandconformationanalysis，MS-SSCA)又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)(BiPS),1999年由Maekawa等报道。方法是:-37- 第四军医大学硕士学位论文先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增,扩增产物变性后行非变性的聚丙酰胺凝胶电泳,由于DNA电泳时的移动性取决于DNA的空间构象,而后者由DNA碱基序列所决定。因此，经处理后变性的单链DNA将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的单链就被分离开,根据电泳条带明确待测片段甲基化情况。这种方法的优点是:①可用于等位基因甲基化的分析；②能够提示甲基化状态分布的不均性。缺点是：①只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低；②检测片段不宜过长。2.9甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳Cariello等(1988年)报道的变性梯度凝胶电泳(methylation-specificdenaturinggradientgelelectrophoresis，MS-DGGE)是一种能够将单碱基差别的DNA分离的方法，其原理是：当双链DNA在变性梯度凝胶中行到与DNA变性温度一致的位置时，DNA部分解链(解链区域的长度大小不等),与每一个解链区域相对应的温度称为解链温度(Tm)。Tm主要由核苷酸序列决定，这是因为DNA链上相邻碱基间的相互作用对稳定DNA双螺旋起重要作用。因此，很小的变化(如单碱基变化)也会引起DNA片段Tm值的改变。DGGE系统中，DNA片段在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳时，由于凝胶中变性剂浓度自上而下呈梯度递增，因此，当DNA片段到达与该区域Tm值相当的某一浓度位置时，DNA解链变为分枝状,其移动减慢,停留在凝胶的某一位置，这样不同的DNA片段就被分离。Aggerholm等(1999-38- 第四军医大学硕士学位论文年)将其用于甲基化的检测，先用重亚硫酸盐处理DNA使为甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，引起点突变，这样再结合使用DGGE，电泳分离技术以分析待测片段的甲基化情况。这种方法的优点是：DGGE可以用来检测出除最高温度解链区域以外的所有发生甲基化的DNA片段，需样品量少，能较直观[67]的显示出甲基化情况。缺点是:解链温度和DGGE的变性浓度梯度需要摸索。[68]2.10甲基化敏感性解链曲线分析：Worm等报道的甲基化敏感性解链曲线分析(methylation-specificmeltingcurveanalysis，MS-MCA)是将DNA经重亚硫酸盐处理与Lightcycle联用的一种方法。荧光素标记双链DNA，监测反应中荧光度对应的解链温度。在Lightcycle过程中,随着温度升高，逐渐达到DNA双链各区域的解链温度Tm，DNA区域性解链。一般说来，序列中CG含量越高,对应的解链温度越高。由于非甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理后变为尿嘧啶、PCR后变为胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，热稳定性降低，解链温度降低；而甲基化的则由于其CG含量高，故其解链温度高。最后,将结果与标准曲线比较，明确研究序列中CpG的分布区及甲基化程度。这是一种能对甲基化分布不均匀的DNA样本进行半定量分析的方法。缺点是：①它不能够精确检测甲基化的具体位点；②研究序列的长度不宜过长；③该法对低水平的DNA甲基化敏感性[69]低。[70]2.11甲基化敏感性斑点分析：Clement等报道了甲基化敏感性斑点分析(methylationsensitivedotblotassay，MS-DBA)方法,能够-39- 第四军医大学硕士学位论文定量或半定量分析样本中的甲基化水平。这个方法的过程是：先用重亚硫酸盐处理待测DNA片段，随后以非CG区的引物行PCR扩增，将扩增产物变性后转移到尼龙膜上，用3′端DIG标记的含有2个CG(或TG)的双核苷酸探针与DNA杂交，随后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应。与双CG的探针获得杂交样本含有甲基化，而与TG探针杂交的样本则未被甲基化，通过比较斑点上荧光的强度进行甲基化水平定量。这种方法的优点是快速、简便、易于掌握，一次检测多种样本，包括石蜡包埋样本。缺点是：①检测序列不能过长；②若探针错误杂交或重亚硫酸盐处理不完全，则可能出现假阳性或假阴性结果。2.12MS-MLPA：MS-MLPA(methylation-specificmultiplex[71]ligation-dependentprobeamplification)是Nygren等在MLPA基础上改进后提出的用于检测特异位点甲基化的方法。MLPA中探针设计要求：由两个寡核苷酸部分构成，其中短的部分由合成产生,长的部分来源于phageM13的衍生物，后者中部含有一个靶基因标志的不同定长的核苷酸填充序列，以利于辨别基因组中同时检测的不同靶基因。两个寡核苷酸探针的杂交序列要求与靶基因的CpG位点互补，两个寡核苷酸的末端分别连有5′端及3′端PCR引物。不同于MLPA的是MS2MLPA探针的杂交序列要包含一个甲基化敏感限制性内切酶(如HhaⅠ)的识别位点。具体过程：先用探针与靶基因进行杂交，然后降低反应体系温度，向其中加入连接酶和HhaⅠ。若靶基因中HhaⅠ识别的位点为非甲基化的，则两个寡核苷酸部分不能连接；若含有的位点存在甲基化,则HhaⅠ不切-40- 第四军医大学硕士学位论文割，探针顺利连接，随后的PCR照常进行。最后根据扩增片段明确定靶基因的甲基化情况。这种方法的优点是：①需要样本的数量少，由于探针具有非常短的识别序列，因此MPLA可以用于局部降解的DNA，如石蜡包埋的DNA样本；②可用于分析大量混合样本,可一次检测多个靶基因中CpG位点的甲基化情况。缺点是探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制,且要考虑到所用酶的反应适宜温度。3.甲基化检测技术的应用：诸多的研究甲基化方法从侧面说明甲基化研究难度较大，同时也说明这些方法都有一定的局限性。面对具体问题时需选择最适合的解决方法。首先，根据研究目的进行选择：是研究整体水平的甲基化还是特定位点的甲基化；其次，根据客观条件进行筛选，如：目标的序列是否已知,研究是否要求定量，样本来源及数量如何，是否需要高通量的样本检测方法；最后，全面分析，选取敏感、可靠、经济、简便的方法，以达到理想的效果。随着对DNA甲基化研究的不断深入，甲基化分析技术也将逐步完善。完善的研究技术将为表观遗传、胚胎发育、基因印记及肿瘤研究提供强有力的技术支持。-41- 第四军医大学硕士学位论文实验部分第一部分DNA靶向性甲基化酶在原核系统中的表达前言已报道，人工锌指可以实现对靶序列的特异性结合，DNA甲基化酶所诱导的基因启动子区CG岛的甲基化可关闭该基因的表达。含DNA靶向性甲基化酶基因的重组质粒pcDNA4-B1-3a-Myc-6His由本课题组李福洋博士构建。初步研究显示，该酶可以使HEK293细胞中瞬时转染的质粒中含有该酶靶序列的启动子发生甲基化，并抑制基因的表达。为进一步量化重组DNA靶向性甲基化酶同靶序列的结合活性及催化活性，克隆并表达、纯化获得重组DNA靶向性甲基化酶则尤为重要。在本实验中，根据本室保存的含重组DNA靶向性甲基化酶基因的质粒pcDNA4-B1-3a-Myc-6His设计了上下游引物，进行PCR扩增。所获取的特异性PCR产物插入pMD19-T载体中，经PCR、双酶切鉴定后测序验证。测序结果经BLAST程序同模板序列进行比对。-42- 第四军医大学硕士学位论文一、材料和方法（一）材料与仪器1.XL-10、BL21菌种和pET32a载体为Invitrogen公司产品。重组质粒pcDNA4-B1-3a-Myc-6His由本室保存。2.EDTA、丽春红S和低分子量蛋白标准品购于洛阳华美生物技术公司。3.琼脂糖和低分子量蛋白标准品购于洛阳华美生物技术公司。4.T4连接酶、限制性内切酶BglⅡ、BamHI和NotI、DNA分子量标准品（DL2000）、pMD19-T载体、IPTG、TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、dNTPs购于大连宝泰克生物工程有限公司。5.质粒提取试剂盒和PCR产物胶回收试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。6.PCR引物的合成及重组质粒的序列测定由上海基康生物工程有限公司完成。7.抗6His标签的小鼠单克隆一抗购自本校免疫学教研室；HRP标记的羊抗小鼠二抗均购自美国SantaCruz生物技术公司；蛋白印迹实验用发光底物为美国Pierce公司产品；硝酸纤维素滤膜购于英国Amersham公司；Tween-20购于美国Sigma公司。8.主要仪器：PCR热循环仪PE2400：美国PE公司5415D微量高速离心机：德国Eppendorf公司GL-20A全自动高速冷冻离心机：湘西仪器仪表总厂TG16A-W微量高速离心机：湖南仪器仪表总厂兴华仪表厂-43- 第四军医大学硕士学位论文SHZ82恒温振荡器和生化培养箱：常州国华电器有限公司HH-2数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司双恒电泳仪BDF1600：北京东方仪器厂超声发生仪（UltrasonicHomogenizer4710）：美国ColeParmer公司双恒电泳仪BDF1600：北京东方仪器厂蛋白转移电泳仪PowerPAC300：美国BIO-RAD公司微量电子天平AY120：日本SHIMADZU公司（二）主要试剂配方1.LB培养基：酵母提取物5g，NaCL10g，YPD10g，加水至1L。2.菌种保存液：50%灭菌甘油与菌液按等比例混合。3.裂解缓冲液（Lysisbuffer）（pH8.0）-1Na2HPO4·2H2O50mM·L-1NaCL300mM·L4.PBST：NaCL，8g；KCl，0.2g；Na2HPO4，1.44g；K2HPO4，0.24g；Tween-20：0.5ml，蒸馏水1000ml，HCl调pH至7.4。5.转移电泳缓冲液：Tris碱，3.03g；甘氨酸，14.4g；甲醇，200ml；蒸馏水，800ml。6.丽春红染液（10×）：丽春红S，2g。-44- 第四军医大学硕士学位论文（三）方法1.引物设计依据DNA靶向性甲基化酶基因序列设计了两端的引物。并在5'端和3'端分别引入BglⅡ和NotI位点。同时合成了pET32a原核表达载体的通用引物S-Tag和T7R。引物由上海基康生物工程有限公司合成。DNA靶向性甲基化酶重组基因正向引物（PET5）:5'-GAAGATCTGCAGAGGAACGCCCATATGC-3'反向引物（PET3）:5'-TTTGCGGCCGCTCACACACAAGCAAAATATTCCTTC-3'pET32a原核表达载体的通用引物正向引物（S-Tag）:5'-CGGTTCTGGTTCTGGCCATA-3'反向引物（T7R）:5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'2.pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒由本室于-20℃保存。3.PCR扩增反应取1µlpcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒为模板，在100µlPCR扩增反应体系中先将模板于97℃变性5min（热启动过程），加入PfuDNA聚合酶，在PE2400PCR热循环仪中循环30次。PCR反应体系：质粒模板1.0µl10×缓冲液10.0µl-1dNTPs（2.5mM·L）8.0µl-1上游引物（10pM·µl）2.0µl-45- 第四军医大学硕士学位论文-1下游引物（10pM·µl）2.0µl灭菌双蒸水（ddH2O）75.0µl-1PfuDNA聚合酶（5u·µl）2.0µl反应体系（共计）100.0µl循环参数：94℃，30s；55℃，30s；72℃，2.5min；循环30次，最后一个循环在72℃延伸7min。4.PCR产物的克隆、亚克隆及测序：（1）PCR产物经琼脂糖电泳纯化和凝胶回收（参照天根胶回收试剂盒说明），直接与pMD19-T载体连接。（2）转化大肠杆菌E.coliXL10：连接产物与100µl感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，迅速冰浴2min，加入900µlLB（无Amp），37℃培养45-60min，3，000rpm离心3min，弃650µl，剩余部分重新悬浮，铺板接种至LB培养基（含Amp、IPTG、X-gal），37℃培养12hr。（3）选取白色克隆，扩增细菌，收获细菌并提取质粒（参照天根质粒提取试剂盒说明），目的基因的重组质粒用BglⅡ和NotI酶切鉴定。（4）用BglII和NotI从pMD19-T-B1-3a中切下B1-3a；将该片段插入经BamHI和NotI酶切的pET-32a表达载体中，转化大肠杆菌XL-10感受态细胞。（5）挑克隆，用菌落PCR法鉴定。（6）挑取鉴定为阳性的克隆，摇菌，提取质粒。（7）将含有预期大小插入片段的质粒经测序验证。含有预期大小插入片段的质粒命名为pET-32a-B1-3a。-46- 第四军医大学硕士学位论文5．大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）：（1）挑取大肠杆菌XL10单个菌落于5ml无Amp的LB培养基，37℃培养过夜。（2）以2%的体积比扩大培养2.5hr，至细菌对数生长期（OD约为0.4）。（3）冰浴10min，5,000rpm离心10min收菌。（4）加入1/2体积冰预冷的CaCl（20.1M），重悬，冰浴15min。（5）5,000rpm离心5min，加入1/25体积冰预冷的CaCl2（0.1M），重悬。加入50%甘油混匀，-70℃储存。6.菌落PCR法筛选克隆：（1）于超净台中挑取6个菌落，分别溶至25µl灭菌去离子水中，用移液器混匀，分别取2µl此菌液至200µl含Amp的LB培养液中。（2）将细菌-培养液置37℃孵箱。将23微升菌液煮沸3min，室温，10,000rpm离心10min。（3）取2µl离心后的上清至25µlTaqPCR体系中，引物是载体（pET32a）的通用引物S-Tag和T7R，25个循环。（4）取5µlPCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳。7．融合蛋白的表达：-47- 第四军医大学硕士学位论文（1）重组表达质粒pET32a-B1-3a转化BL-21感受态细胞。-1（2）分别挑取单菌落接种于5mlLB(0.1g·LAmp)中，37℃培养过夜。-1-1（3）以2%体积比转接于200mlLB(0.1g·LAmp，100μM·L-1ZnSO4)中，37℃继续培养2.5hr，至细菌对数生长期，加0.5mM·LIPTG200µl诱导3-4hr。（4）12,000rpm离心3min收取菌体沉淀。8.重组蛋白的可溶性分析：（1）取0.3g表达6His-B1-3a融合蛋白的菌体，重悬于3ml-1裂解缓冲液中，加入PMSF至终浓度为10mM·L，冰浴超声裂菌60Hz，5次，每次15s。（2）41℃2,000rpm离心10min；分别取上清和沉淀加入5×加样缓冲液，煮沸5min变性，12，000rpm离心10min。（3）分别取变性后的上清和沉淀样品10µl进行SDS-PAGE电泳分析（10%）。9.重组蛋白的蛋白印迹验证（增强化学发光蛋白免疫印迹法）：（1）取6His-B1-3a融合蛋白进行10%的SDS-PAGE，然后电转移于NC膜上。-48- 第四军医大学硕士学位论文（2）将膜浸在封闭液中（PBST溶解的5%脱脂奶粉），4℃封闭过夜。（3）用PBST洗三次，每次10min。将膜与第一抗体共同孵育1hr，其中第一抗体用PBST缓冲液按1∶1000稀释，然后用PBST缓冲液洗膜3次，每次10min。（4）将膜与辣根过氧化物酶标记的第二抗体（用PBST缓冲液预先按1∶3000稀释该抗体）共同孵育1hr，然后用PBST缓冲液洗膜3次，每次10min。（5）将膜放在等体积比配制的检测试剂1和2的混合液中孵育约1min。（6）在暗室中用X光片曝光5s至数分钟，直至显影出理想条带。-49- 第四军医大学硕士学位论文二、结果1.B1-3a的PCR产物用高保真PCR技术，从pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒中扩增得到B1-3a的DNA片段（见图1）。图1中的B1-3aPCR产物与预计大小（1,257bp）一致。bpM120001000750500250100图1B1-3a基因的PCR电泳图Fig.1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofB1-3a-6His-geneM:DNAmarkerDL20001:PCRproduct(1257bp)2.克隆载体的酶切鉴定：将纯化的PCR产物加脱氧腺嘌呤（A）尾后插入pMD19-T载体中，根据3'和5'端引物所带的限制性内切酶位点进行酶切鉴定。pMD19-T-B1-3a用BglII和NotI鉴定。酶切消化的目的片段与设计大小相符，证明克隆载体的构建是成功的（见图2）。-50- 第四军医大学硕士学位论文bpM123420001000750500250100图2pMD19-T-B1-3a重组载体的双酶切鉴定Fig.2AnalysisofpMD19-T-B1-3arecombinantvectorM:DNAmarkerDL20002、3:pMD19-T-B1-3aDigestedbyBglIIandNotI3.表达载体的构建及鉴定：用BamHI和NotI将B1-3a从pMD19-T-B1-3a载体中切下，插入BglII和NotI酶切的pET32a表达载体中，再用pET32a表达载体的通用引物S-Tag和T7R鉴定，目的片段与设计大小(1,257bp)一致（见图3）。图4a,b为B1-3a的上下游测序结果。测序结果经BLAST程序同模板序列进行比对后序列一致。由此证实，成功地构建了pET32a-B1-3a表达载体。bpM12345620001000750500250100图3pET32a-B1-3a重组载体的菌落PCR鉴定Fig.3AnalysisofpET32a-B1-3arecombinantvectorM:DNAmarkerDL20002、4、5、6:PCRproductsofpET32a-B1-3a-51- 第四军医大学硕士学位论文图4a重组质粒pET32a-6His-B1-3a上游测序验证Fig4aUpstreamsequencingchartofrecombinantplasmidpET32a-6His-B1-3a-52- 第四军医大学硕士学位论文图4b重组质粒pET32a-6His-B1-3a下游测序验证Fig4bDownstreamsequencingchartofrecombinantplasmidpET32a-6His-B1-3a-53- 第四军医大学硕士学位论文4.6His-B1-3a融合蛋白的表达形式分析和WesternBlot鉴定6His-B1-3a的理论相对分子量约为43.0kDa，经IPTG诱导表达，获得的表达蛋白比预期大(左箭头所指)。图5中1、2、3三个泳道分别代表6His-NDRG3融合蛋白在总蛋白、上清和沉淀中的分布，图6为WesternBlot结果。可见6His-B1-3a融合蛋白分布在沉淀中，以包涵体的形式存在。Mr(kD)12345678997.466.243.031.020.1图56His-B1-3a的表达形式分析Fig.5SDS-PAGEanalysisofexpressionformof6His-B1-3afusionproteins.1:proteinmarker;2:pET32ainBL-21notinducedbyIPTGinLBmedia;3:pET32ainBL-21inducedbyIPTGinLBmedia;4:supernatantofbacteriallysateofpET32ainBL-21inducedbyIPTGinLBmedia;5:precipitateofbacteriallysateofpET32ainBL-21inducedbyIPTGinLBmedia;6:pET32a-B1-3ainBL-21notinducedbyIPTGinLBmedia;7:pET32a-B1-3ainBL-21inducedbyIPTGinLBmedia;8:supernatantofbacteriallysateofpET32a-B1-3ainBL-21inducedbyIPTGinLBmedia;9:precipitateofbacteriallysate(containing6His-B1-3afusionprotein);-54- 第四军医大学硕士学位论文123456图6.6His-B1-3a融合蛋白WesternBlot鉴定Fig6.Analysisof6His-B1-3afusionproteinbyWesternBlot1、3、5：supernatantofbacteriallysateofpET32a-B1-3ainBL-212、4、6：precipitateofbacteriallysateofpET32a-B1-3ainBL-21三、讨论为获得DNA靶向性甲基化酶B1-3a，在体外分析其靶向性甲基化的特异性及效率等性能参数，本实验在此部分中将6His-B1-3a融合蛋白在原核系统中进行了诱导表达。实验结果表明6His-B1-3a在大肠杆菌中的表达形式是包涵体。基于B1-3a结构的复杂性和下游实验对酶活性的要求，未对包涵体进行变性和复性处理。-55- 第四军医大学硕士学位论文第二部分B1-3a-Myc-6His融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化前言为获得可溶形式的B1-3a-Myc-6His融合蛋白，本实验部分在P.pastoris中表达并鉴定了B1-3a-Myc-6His，其中有少量可溶形式蛋白存在。含目的蛋白的酵母细胞裂解上清经Ni-NTA柱离子亲合层析进行纯化，纯化产物的分子量小于目的蛋白的分子量，经肽指纹图谱和串联质谱分析鉴定后，推测纯化产物可能是酵母细胞的一种内源性蛋白。由于该内源性蛋白的干扰，未能在此部分实验中获得纯化的B1-3a-Myc-6His融合蛋白。-56- 第四军医大学硕士学位论文一、材料和方法（一）材料与仪器1.XL-10菌种、pPIC3.5k酵母表达载体、酵母GS115菌种、氨基酸混合物为Invitrogen公司产品。重组质粒pcDNA4-B1-3a-Myc-6His由本室保存。2.酵母氮碱（YNB）、酸洗玻璃珠、Tween-20为Sigma公司产品。蛋白胨购于北京原平皓生物技术有限公司。3.电转化杯为Bio-RAD公司产品。4.咪唑、PMSF、生物素、PCRmarker和DL2000、TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶BglⅡ、BamHI、NotI和SacI购于大连宝泰克生物工程有限公司。5.质粒提取试剂盒和PCR产物胶回收试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。6.山梨醇、T4连接酶、低分子量蛋白Marker、G418、葡萄糖购于华美生物技术公司。7.PCR引物的合成及重组质粒的序列测定由上海基康生物工程有限公司完成。8.Ni-NTA亲合介质购于Qiagen公司。9.抗Myc标签的小鼠单克隆一抗购自本校免疫学教研室；HRP标记的羊抗小鼠二抗均购自美国SantaCruz生物技术公司；蛋白印迹实验用发光底物为美国Pierce公司产品；硝酸纤维素滤膜购于英国Amersham公司。10.主要仪器：PCR热循环仪PE2400：美国PE公司-57- 第四军医大学硕士学位论文5415D微量高速离心机：德国Eppendorf公司GL-20A全自动高速冷冻离心机：湘西仪器仪表总厂TG16A-W微量高速离心机：湖南仪器仪表总厂兴华仪表厂SHZ82恒温振荡器和生化培养箱：常州国华电器有限公司HH-2数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司双恒电泳仪BDF1600：北京东方仪器厂双恒电泳仪BDF1600：北京东方仪器厂蛋白转移电泳仪PowerPAC300：美国BIO-RAD公司微量电子天平AY120：日本SHIMADZU公司电转化仪GenePulserII：美国Bio-RAD公司（二）主要试剂配方1.储存液（1）10×YNB：13.4g酵母氮碱（含硫酸铵，不含氨基酸），溶于100ml蒸馏水，无菌过滤，储存于4℃。（2）500×B（0.02%）：溶解10mg于50ml去离子水，无菌过滤，储存于4℃。（3）100×AA（分别0.5%的五种氨基酸）：溶解各500mg的谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸和异亮氨酸于100ml去离子水中，无菌过滤，储存于4℃。（4）10×D：溶解20g葡萄糖于100ml去离子水中，无菌过滤，储存于室温。2.YPD培养液（1L）：溶解10g酵母提取物和20g蛋白胨于5900ml蒸馏水中，（若配YPD培养板，加入20g琼脂粉），10Pa，-58- 第四军医大学硕士学位论文121℃，灭菌20min。灭菌后温度降至50-60℃时加入100ml20%葡萄糖。3.RDB培养板：溶解18.6g山梨醇于70ml蒸馏水中，加入2g5琼脂粉，10Pa，121℃，灭菌20min。灭菌后温度降至50-60℃时加入预热（45℃）的下列混合物：10ml10×D、10ml10×YNB、0.2ml500×B、1ml100×AA和8.8ml灭菌去离子水。混匀铺板，储存于4℃。4.MGY培养液：在800ml灭菌去离子水中加入100ml10×YNB，2ml500×B和100ml10×GY，储存于4℃。5.MM培养基：在800ml灭菌去离子水中加入100ml10×YNB、2ml500×B和100ml10×GY，储存于4℃。6.酵母玻璃珠破菌缓冲液：6g磷酸钠，372mgEDTA溶于900ml去离子水中，加入50ml甘油，调pH值至7.4。加水补至体积为1L。使用前加入200mMPMSF至终浓度为1mM。7.裂解缓冲液（100ml）：50mMNaH2PO4（0.78g），300mMNaCl（1.75g），10mM咪唑（1ml1M咪唑），调pH至8.0。8.洗涤缓冲液（100ml）：50mMNaH2PO4（0.78g），300mMNaCl（1.75g），50mM咪唑（5ml1M咪唑），调pH至8.0。9.洗脱缓冲液（100ml）：50mMNaH2PO4（0.78g），300mMNaCl2（1.75g），200mM咪唑（1.7g咪唑），调pH至8.0。（三）方法：1.靶向性甲基化酶B1-3a基因扩增以本室所存pcDNA4-B1-3a--Myc-6His质粒为模板，通过PCR法扩增获得融合myc-his标签的甲基化酶B1-3a基因片段，PCR体-59- 第四军医大学硕士学位论文系中所用DNA聚合酶为高保真PfuDNA聚合酶，所用上游引物和下游引物序列分别为：上游引物：5'-GAAGATCTGCGCCACCATGGCAGAGGAACG-3'；下游引物：5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGAT-3'。扩增条件为：96℃预变性300s，然后按94℃30s，55℃30s，72℃150s扩增30个循环，最后72℃延伸5min。2.重组质粒pPIC3.5k-B1-3a的构建-1扩增产物由BglII、NotI双酶切，酶切产物行10g·L琼脂糖凝胶电泳，经DNA胶回收获得目的片段。pPIC3.5k由BamHI、-1NotI双酶切，酶切产物行5g·L琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收。回收产物经T4连接酶连接后得目的质粒pPIC3.5k-B1-3a。将目的-1质粒转化XL10感受态细胞，转化菌涂布于含0.1g·LAmp的低盐LB固体培养基平板上，37℃孵育。随机挑取转化后长出的单菌-1落于0.1g·LAmp的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒。以提取质粒为模板，用TaqDNA聚合酶，pPIC3.5k的通用引物5'AOX、3'AOX，扩增条件为：96℃预变性300s，然后按94℃30s，55℃30s，72℃90s扩增30个循环，最后72℃延伸5min。10-1g·L琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果。重组质粒DNA的序列测定委托北京三博生物技术公司进行。测序引物为pPIC3.5k的通用引物5'AOX、3'AOX。3.重组pPIC3.5k-B1-3a质粒转化P.pastoris取90μl酵母感受态细胞与5μg由SacI线性化的重组质粒混-60- 第四军医大学硕士学位论文合，冰浴5min，用Bio-Rad电转仪于1.8kV，25μF，200Ω条件下电转化。电击后立即加入1ml1M冰浴山梨醇溶液，混匀，取300μl均匀涂布于RDB平板，30℃培养72h。4.阳性克隆的筛选与鉴定-1收取RDB平板上的菌落，10倍系列稀释，涂于浓度为1~4g·L-1的YPD-G418平板上，挑取4g·LG418-YPD平板上的菌落分别接种至5mlYPD液体培养基中，30℃培养18h，取3ml菌液，10,000rpm离心后用酵母基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA。取1μl作为模板，以通用引物5'AOX、3'AOX行PCR扩增，扩增条件为：96℃预变性300s，然后按94℃30s，55℃30s，72℃-190s扩增30个循环，最后72℃延伸5min。10g·L琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果。5.B1-3a-Myc-6His融合蛋白在P.pastoris中的表达及鉴定+本实验挑选的均为Mut表型（甲醇快利用型），将阳性菌株接种至YPD培养基平板，30℃培养72h后，挑取单克隆接种至5mlMGY培养液中，30℃，220rpm，培养18h，至OD600为5，1,500rpm离心，收集菌体并转接至50mlMM培养液（1%V/V甲醇，-1100μM·LZnSO4）中，30℃，220rpm，培养72h，其间每24h-1加入甲醇至终浓度为10g·L，8,000rpm离心5min，弃上清，以酸洗玻璃珠法裂菌，4℃12,000rpm离心10min，分别取上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳，并以Myc标签单克隆抗体行WesternBlot鉴定。6.B1-3a-Myc-6His融合蛋白的亲合纯化：用10ml裂解液平衡Ni-NTA柱，将裂菌液上样。用5ml裂-61- 第四军医大学硕士学位论文解缓冲液洗柱，再用15ml洗涤缓冲液平衡镍柱。用1×3ml洗脱缓冲液洗脱B1-3a-Myc-6His融合蛋白。7.纯化蛋白行SDS-PAGE电泳后，取蛋白样品送上海基康生物技术有限公司进行肽指纹图谱分析和串联质谱分析，以所得氨基酸序列在相关蛋白质数据库中检索。二、结果1.重组质粒的构建与鉴定以pcDNA4-B1-3a-Myc-6His为模板扩增获得B1-3a片段，行BglII、NotI双酶切后克隆入pPIC3.5k载体，以重组载体转化感受态XL10细胞，随机挑取转化的大肠杆菌，提取质粒行PCR鉴-1定。PCR产物行10g·L琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示，所得片段大小为1,500bp左右，同目的片段相符。将PCR检测正确的重组质粒载体进行序列测定。测序结果（图7a，b）证实插入序列与设计序列完全一致，表明重组酵母表达质粒构建成功。12bp20001000750500250100图6.B1-3a-Myc-6His基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig6.AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofB1-3a-6His-Mycgene1：DNAmarkerDL2000；2：PCRproduct2.重组酵母总DNA的PCR鉴定以提取的重组酵母总DNA作为模板，以5'AOX和3'AOX作-62- 第四军医大学硕士学位论文为引物进行PCR扩增，结果由图8所示，第2泳道扩增出大小分别为1,500pb和2,200bp的两条电泳条带。1,500bp电泳条带为基因B1-3a，表明该基因已整合入酵母GS115基因组DNA中。2,200-63- 第四军医大学硕士学位论文图7a.重组质粒pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His上游测序验证Fig7a.UpstreamsequencingchartofrecombinantplasmidpPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-64- 第四军医大学硕士学位论文图7b.重组质粒pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His下游测序验证Fig7b.DownstreamsequencingchartofrecombinantplasmidpPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-65- 第四军医大学硕士学位论文+bp条带为扩增酵母AOX基因所得，说明此克隆为Mut型。123bp20001000750500250100图8.重组酵母转化子基因组DNA的PCR鉴定Fig8.PCRindentificationoftherecombinantyeastclonesbygenomicDNA1：MarkerDL2000；2：Clone1；3：Clone2；3.B1-3a-Myc-6His融合蛋白的SDS-PAGE分析及WesternBlot鉴定重组酵母经甲醇诱导后，取酵母裂解产物的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，以无外源基因插入酵母细胞的裂解产物的上清和沉淀为对照。电泳结果如图9所示，同未诱导对照相比，经甲醇诱导后的阳性克隆在50kD左右出现表达条带，其大小与目的蛋白质大小相符，且大部分蛋白质以包涵体形式存在于沉淀中，如图10所示，用抗myc标签单克隆抗体在相同位置可以检测到目的蛋白的表达。1234567Mr(kD)97.466.243.031.0-66- 第四军医大学硕士学位论文图9.靶向性甲基化酶B1-3a的SDS-PAGE分析Fig9.ExpressionanalysisofB1-3a-Myc-6HisbySDS-PAGE1：proteinmarker；2：supernatantofyeastlysateofGS115notinducedbymethanol；3：precipitateofyeastlysateofGS115notinducedbymethanol；4：supernatantofyeastlysateofClone1inducedbymethanol；5：supernatantofyeastlysateofClone2inducedbymethanol；6：precipitateofyeastlysateofClone1inducedbymethanol；7：precipitateofyeastlysateofClone2inducedbymethanol;1234图10.靶向性甲基化酶B1-3a-Myc-6His的WesternBlot鉴定Fig10.IdentificationofB1-3a-Myc-6HisbyWesternBlot1：supernatantofyeastlysateofClone1；2：precipitateofyeastlysateofClone1；3：supernatantofyeastlysateofClone2；4：precipitateofyeastlysateofClone2;Mr(kD)1234567891097.466.243.031.020.114.4图11.酵母表达菌体的裂菌液上清纯化产物SDS-PAGE分析Fig11.AnalysisofpurifiedproductofthesupernatantofyeastlyateofinducedClone1-67- 第四军医大学硕士学位论文1:proteinmarker2:yeastlysateofClone1inducedbymethanol；3:supernantantofyeastlysateofClone1inducedbymethanol；4:fractionflowedthrough-1Ni-NTAagarose；5-10:elutedfractionofimidazole(200mM·L);4.B1-3a-Myc-6His融合蛋白的亲合纯化利用Ni-NTAagarose柱通过金属螯合亲合层析进行纯化，从酵母表达菌体的裂菌液上清中纯化得到分子量约为40kD的蛋白(右箭头所指)。B1-3a-Myc-6His融合蛋白共有439个氨基酸，理论估算B1-3a-Myc-6His融合蛋白的分子量应为50kD左右。纯化产物行SDS-PAGE如图11所示：5.纯化蛋白的肽指纹图谱分析和串联质谱分析（图12a-e）结果及相关蛋白质数据库查询结果：图12-a.纯化产物的肽指纹图谱Fig11-a.Peptidemassfingerprintofpurifedproduct-68- 第四军医大学硕士学位论文图12-b.纯化产物的肽指纹图谱Fig12-b.Peptidemassfingerprintofpurifedproduct图12-c.纯化产物的肽指纹图谱Fig12-c.Peptidemassfingerprintofpurifedproduct-69- 第四军医大学硕士学位论文图12-d.纯化产物的肽指纹图谱Fig12-d.Peptidemassfingerprintofpurifedproduct图12-e.纯化产物的肽指纹图谱Fig12-e.Peptidemassfingerprintofpurifedproduct在不同物种的蛋白质数据库中的检索结果如下所述：（1）人类蛋白质数据库：-70- 第四军医大学硕士学位论文User:proteinEmail:protein@genecore.comSearchtitle:B1-3aDatabase:NCBInr20060831(3894824sequences;1340658132residues)Taxonomy:Homosapiens(human)(153777sequences)Timestamp:6Sep2006at06:01:30GMTTopScore:41forgi|34528869,unnamedproteinproduct[Homosapiens]ProbabilityBasedMowseScoreProteinscoreis-10*Log(P),wherePistheprobabilitythattheobservedmatchisarandomevent.Proteinscoresgreaterthan64aresignificant(p<0.05).（2）真菌蛋白质数据库：User:proteinEmail:protin@genecore.comSearchtitle:B1-3aDatabase:NCBInr20060831(3894824sequences;1340658132residues)Taxonomy:Fungi(202944sequences)Timestamp:8Sep2006at03:55:54GMTTopScore:62forgi|70981861,O-methylsterigmatocystinoxidoreductase[AspergillusfumigatusAf293]ProbabilityBasedMowseScoreProteinscoreis-10*Log(P),wherePistheprobabilitythattheobservedmatchisarandomevent.Proteinscoresgreaterthan66aresignificant(p<0.05).-71- 第四军医大学硕士学位论文（3）酿酒酵母蛋白质数据库：User:proteinEmail:protein@genecore.comSearchtitle:B1-3aDatabase:NCBInr20060831(3894824sequences;1340658132residues)Taxonomy:SaccharomycesCerevisiae(baker'syeast)(11101sequences)Timestamp:6Sep2006at09:48:49GMTTopScore:50forgi|6320085,Putativemitochondrialtransportprotein;localizestothemitochondrion;YDL119Cisnotanessentialgene;Ydl119cp[Saccharomycescerevisiae]ProbabilityBasedMowseScoreProteinscoreis-10*Log(P),wherePistheprobabilitythattheobservedmatchisarandomevent.Proteinscoresgreaterthan53aresignificant(p<0.05).-72- 第四军医大学硕士学位论文肽指纹图谱分析和串联质谱分析及相关蛋白质数据库查询的结果显示，得分最高（62分）的是一种真菌蛋白O-methylsterigmatocystinoxidoreductase。由此可推测，纯化产物可能是酵母细胞的一种内源性蛋白。未能经此步骤获得纯化目的蛋白B1-3a-Myc-6His。三、讨论作为一种新的特异性基因沉默手段,靶向性甲基化在基础研究领域和临床治疗方面都将具有重要的应用价值。除此之外，靶向性DNA甲基化还可以用来纠正一些区域性的甲基化缺失，如印迹丢失等，为某些表观遗传疾病的治疗提供一种全新的策略。本实验部分在P.pastoris中表达并鉴定了靶向性甲基化酶B1-3a，其中有少量可溶形式蛋白存在。在离子亲合层析过程中，由于可溶形式的目的蛋白含量较低，同时存在酵母细胞内源性蛋白的干扰，所以未能在此部分实验中获得纯化的B1-3a-Myc-6His融合蛋白。在以后的实验中，有望通过改善诱导表达条件和亲合层析纯化条件获得有功能的重组靶向性DNA甲基化酶。本实验为建立体外靶向性DNA甲基化以及通过体外分析获得靶向性DNA甲基化酶的重要性能参数奠定了一定的基础。-73- 第四军医大学硕士学位论文第三部分毕赤酵母基因组中人工靶基因的构建和甲基化水平检测前言在本部分实验中，利用毕赤酵母表达载体pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS可通过同源重组将目的片段B1-3a-Myc-6His-BS整合入酵母基因组的特点，构建整合入酵母基因组的人工基因，在诱导B1-3a-Myc-6His融合蛋白表达24h后，提取酵母基因组DNA，通过甲基化特异的PCR法检测人工基因中CpG位点的甲基化情况。但未见CpG位点的甲基化。可能与蛋白表达量低、锌指结构域的错误折叠、B1-3a-Myc-6His融合蛋白的入核效率低等因素有关。-74- 第四军医大学硕士学位论文一、材料和方法（一）材料与仪器1.重亚硫酸钠和氢醌为Sigma公司产品。2.酵母基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。3.其余同第二部分。（二）主要试剂配方1.储存液、YPD培养液、RDB培养板、MGY培养液、MM培养基、酵母玻璃珠破菌缓冲液、裂解缓冲液和洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的配制同第二部分。2.3MNaOH（100ml）：溶解12gNaOH于80ml蒸馏水中，搅拌溶解后定容至100ml。3.8MNH4Ac（100ml）：溶解61.6gNH4Ac于50ml蒸馏水中，搅拌至大部分溶解后，缓慢加蒸馏水至100ml。4.2.3M亚硫酸钠溶液（4ml）：1.76g重亚硫酸钠溶解于3ml蒸馏水中，加入340μl3MNaOH。此溶液需即用即配，不可久置。5.20mM氢醌（50ml）：0.11g氢醌溶解于50ml蒸馏水中，搅拌混匀。此溶液需即用即配，不可久置。（三）方法：1.3'端带锌指结合序列的B1-3a-Myc-6His基因的扩增以本室所存pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒为模板，设计3'端引物，通过两次PCR，将B1-3a-Myc-6His的锌指结构于域所识别的DNA序列（BS）引入B1-3a-Myc-6His序列的3'端的终止密码子下游，PCR体系中所用DNA聚合酶为高保真PfuDNA聚合酶，-75- 第四军医大学硕士学位论文所用上游引物和下游引物序列分别为：上游引物：5'-GAAGATCTGCGCCACCATGGCAGAGGAACG-3'；下游引物1：5'-CTCATTACCGCCCGATCCGGCTCAATGGTGATGGTGATGAT-3'；下游引物2：5'-ATAAGAATGCGGCCGCGGCATCTCATTACCGCCCGATCCGG-3'；扩增条件为：96℃预变性300s，然后按94℃30s，55℃30s，72℃150s扩增30个循环，最后72℃延伸5min。2.重组质粒pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS的构建-1扩增产物由BglII、NotI双酶切，酶切产物行10g·L琼脂糖凝胶电泳，经DNA胶回收获得目的片段。pPIC3.5k由BamHI、-1NotI双酶切，酶切产物行5g·L琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收。回收产物经T4连接酶连接后得目的质粒pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS。将目的质粒转化XL10感受态细胞，-1转化菌涂布于含0.1g·LAmp的低盐LB固体培养基平板上，37℃-1孵育。随机挑取转化后长出的单菌落于0.1g·LAmp的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒。以提取质粒为模板，用TaqDNA聚合酶，pPIC3.5k的通用引物5'AOX以及下游引物2，扩增条件为：96℃预变性300s，然后按94℃30s，55℃30s，72℃90s扩-1增30个循环，最后72℃延伸5min。10g·L琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果。重组质粒DNA的序列测定委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行。测序引物为pPIC3.5k的通用引物5'AOX、3'AOX。-76- 第四军医大学硕士学位论文3.重组质粒pPIC3.5k-B1-3a-BS转化P.pastoris取90μl酵母感受态细胞与5μg由SacI线性化的重组质粒混合，冰浴5min，用Bio-Rad电转仪于1.8kV，25μF，200Ω条件下电转化。电击后立即加入1ml1M冰浴山梨醇溶液，混匀，取300μl均匀涂布于RDB平板，30℃培养72h。4.高拷贝克隆的筛选与阳性克隆的鉴定-1收取RDB平板上的菌落，10倍系列稀释，涂于浓度为1~4g·L-1的YPD-G418平板上，挑取4g·LG418-YPD平板上的菌落分别接种至5mlYPD液体培养基中，30℃培养18h，取3ml菌液，10,000rpm离心后用酵母基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA。取1μl作为模板，以通用引物5'AOX、下游引物2行PCR扩增，扩增条件为：96℃预变性300s，然后按94℃30s，55℃30-1s，72℃90s扩增30个循环，最后72℃延伸5min。10g·L琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果。5.B1-3a-Myc-6His融合蛋白在P.pastoris中的表达及鉴定+本实验挑选的均为Mut表型（甲醇快利用型），将阳性菌株接种至YPD培养基平板，30℃培养72h后，挑取单克隆接种至5mlMGY培养液中，30℃，220rpm，培养18h，至OD600为5，1,500rpm离心，收集菌体并转接至50mlMM培养液（1%V/V甲醇，-1100μM·LZnSO4）中，30℃，220rpm，培养24h，8,000rpm离心5min，弃上清，以酸洗玻璃珠法裂菌，4℃12,000rpm离心10min，分别取上清及沉淀以Myc标签单克隆抗体行WesternBlot鉴定。6.酵母基因组DNA的提取：将含有人工基因的酵母克隆按-77- 第四军医大学硕士学位论文照上述步骤5.，诱导表达24小时后，8,000rpm离心5min，弃上清，依据酵母基因组DNA提取试剂盒相关步骤提取酵母基因组DNA。所提取基因组DNA于-20℃冻存。7.重亚硫酸盐处理基因组DNA：（1）BamHI酶切2μg酵母基因组DNA，50μl酶切体系，37℃，8h。（2）用DNA片段回收试剂盒回收酶切的DNA。洗脱得90μlDNA溶液。（3）DNA变性：加入10μl新鲜制备的3MNaOH至终浓度为0.3M，37℃温育20min。（4）在上述体系中加入1040μl新鲜制备的2.3M重亚硫酸钠溶液（pH5.0）、30μl20mM氢醌和20μl去离子水，轻轻颠倒混匀，55℃温育8~16h。（5）用DNA片段回收试剂盒回收酶切的DNA。洗脱得90μlDNA溶液。（6）在上述体系中加入10μl3MNaOH（终浓度为0.3M），37℃温育15min。（7）加入70μl8MNH4Ac中和至pH7.0，加入10μl糖原，混匀，加入3倍体积（400μl）的无水乙醇，混匀后置-20℃，30min。12,000rpm×10min离心，弃上清，于室温晾干后，加入10μl去离子水溶解DNA或直接置-20℃冻存。8.PCR测序：（1）设计不含CpG位点的引物，以锌指结合区域为中心，扩增大小为415bp的DNA片段。上下游引物分别为：-78- 第四军医大学硕士学位论文上游引物：5'-AGGAGGATATTTTGTGGTGTAT-3'下游引物：5'-AATAAAACCTACATCTCTCAA-3'（2）取1μl经重亚硫酸盐处理的基因组DNA为模板，50μlPCR体系中所用DNA聚合酶为高保真PfuDNA聚合酶。扩增条件为：96℃预变性300s，然后按94℃30s，55℃30s，72℃150s扩增30个循环，最后72℃延伸5min。-1（3）PCR产物经10g·L琼脂糖凝胶电泳和凝胶回收，直接与Pmd19-T载体连接。（4）转化大肠杆菌XL10：连接产物与100µl感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，迅速冰浴2min，加入900µlLB（无Amp），37℃培养45-60min，3，000rpm离心3min，弃650µl，剩余部分重新悬浮，铺板接种至LB培养基（含Amp、IPTG、X-gal），37℃培养12hr。（5）选取白色克隆，扩增细菌，送菌液至公司测序。二、结果1.重组质粒的构建与鉴定以pcDNA4-B1-3a-Myc-6His为模板，通过两次PCR，扩增获得B1-3a-Myc-6His-BS片段，行BglII、NotI双酶切后克隆入pPIC3.5k载体，以重组载体转化感受态XL10细胞，随机挑取转化的大肠杆菌，提取质粒行PCR鉴定。PCR产-1物行10g·L琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图14所示，所得片段大小为1,500bp左右，同目的片段相符。将PCR检测正确的重组质粒载体进行序列测定（图15a，b）。测序结果证实插入序列与设计序列完全一致，表明重组酵母表达质粒构建成功。2.重组酵母总DNA的PCR鉴定-79- 第四军医大学硕士学位论文以提取的重组酵母总DNA作为模板，以5'AOX和3'AOX作为引物进行PCR扩增，结果由图16所示，第2、3泳道扩增出大小分别为1,556bp和2,200bp的两条电泳条带。1,556bp电泳条带为B1-3a-Myc-6His-BS，表明该基因已整合入酵母GS115基因组DNA中。2,200bp条带为扩增酵母AOX基因所得，说明此克隆为+Mut型。bpM123420001000750500250100图14.B1-3a-Myc-6His-BS基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig14.AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsofB1-3a-Myc-6His-BSgeneM：DNAmarkerDL2000；1-4：PCRproducts-80- 第四军医大学硕士学位论文图15a.重组质粒pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS上游测序验证Fig15a.UpstreamsequencingchartofrecombinantplasmidpPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS-81- 第四军医大学硕士学位论文图15b.重组质粒pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS下游测序验证Fig15b.DownstreamsequencingchartofrecombinantplasmidpPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS-82- 第四军医大学硕士学位论文bpM1220001000750500250100图16.重组酵母转化子基因组DNA的PCR鉴定Fig16.PCRindentificationoftherecombinantyeastclonesbygenomicDNA1：MarkerDL2000；2：Clone1；3：Clone23.重组产物WesternBlot鉴定重组酵母GS11-B1-3a-Myc-6His-BS经甲醇诱导24h后，取酵母裂解产物的上清和沉淀进行，用抗myc标签单克隆抗体行WesternBlot鉴定，如图17所示，可以检测到目的蛋白的表达。12图17.GS11-B1-3a-Myc-6His-BS中B1-3a-Myc-6His的WesternBlot鉴定Fig17.IdentificationofB1-3a-Myc-6HisbyWesternBlotinGS11-B1-3a-Myc-6His-BS1：yeastlysateofClone1；2：yeastlysateofClone2；3.亚硫酸盐PCR测序重组酵母GS11-B1-3a-Myc-6His-BS经甲醇诱导24h后，提取酵母基因组DNA，经重亚硫酸盐处理后，行PCR，将PCR产物连接入pMD19-T载体，转化XL10感受态细菌，挑取多个克隆，摇菌扩增后，取适量菌液送公司测序。部分测序结果如图18a，b所示。锌指结构域特异识别的DNA序列上下游附近的CpG位点均未发生甲基化。-83- 第四军医大学硕士学位论文图18a.直接基因组测序Fig18a.SequencingchartofmethylationspecificPCRoftheartificialgene-84- 第四军医大学硕士学位论文图18b.直接基因组测序Fig18b.SequencingchartofmethylationspecificPCRoftheartificialgene-85- 第四军医大学硕士学位论文三、讨论本部分实验利用酵母表达载体pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS可通过同源重组将目的片段整合入酵母基因组的特点，构建整合入酵母基因组的人工基因，在诱导B1-3a-Myc-6His融合蛋白表达24h后，提取酵母基因组DNA，通过直接测序法检测人工基因中CpG位点的甲基化情况。但未见CpG位点的甲基化。可能与蛋白表达量低、锌指结构域的错误折叠、B1-3a-Myc-6His融合蛋白的入核效率低等因素有关。-86- 第四军医大学硕士学位论文小结1.以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒为模板，构建了原核表达载体pET32a-B1-3a。在BL21中进行了6His-B1-3a融合蛋白的表达，所得6His-B1-3a融合蛋白均在细菌裂解液的沉淀中，以包涵体的形式存在。2．以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒为模板，构建了原核表达载体pET32a-B1-3a。在毕赤酵母GS115中进行了甲醇诱导表达、SDS-PAGE和WesternBlot鉴定和Ni-NTA柱亲合层析纯化。表达产物大部分以包涵体的形式存在，只有少量以可溶形式分布于酵母细胞裂解上清中。纯化产物经肽指纹图谱分析和串联质谱分析，结果提示该蛋白可能是GS115的一种内源性蛋白，而不是B1-3a-Myc-6His融合蛋白。3.以本室保存的pcDNA4-B1-3a-Myc-6His质粒为模板，构建了含人工基因的酵母表达载体pPIC3.5k-B1-3a-Myc-6His-BS，通过同源重组将目的片段整合入酵母基因组，诱导B1-3a-Myc-6His融合蛋白表达后，提取酵母基因组DNA，用直接基因组测序法检测了人工基因中CpG位点的甲基化情况。但未见CpG位点的甲基化。可能与蛋白表达量低、锌指结构域的错误折叠、B1-3a-Myc-6His融合蛋白的入核效率低等因素有关。-87- 第四军医大学硕士学位论文参考文献：[1]PavletichNP,PaboCO.Zincfinger-DNArecognition:crystalstructureofaZif268DNAcornplex.Science1991;252(5007):809-17.[2]RebarEJPC.Zincfingerphage:affinityselectionoffingerswithnewDNA-bindingspecificities.Science1994;263:671-3.[3]JamiesonACKS-H,WellsJA.InvitroselectionofzincfingerswithalteredDNA-bindingspecificity.Biochemistry1994;33:5689-95.[4]ChooYKA.TowardacodefortheinteractionsofzincfingerswithDNA:selectionofrandomisedzincfingersdisplayedonphage.ProcNatlAcadSciUSA1994;91:11163-7.[5]WuHYW-P,BarbasCFIII.Buildingzincfingersbyselection:towardatherapeuticapplication.ProcNatlAcadSciUSA1995;92:344-8.[6]ChooYS-GI,KlugA.InvivorepressionbyasitespecificDNA-bindingproteindesignedagainstanoncogenicsequence.Nature1994;372:642-5.[7]KimJ-SPC.GettingahandholdonDNA:designofpoly-zincfingerproteinswithfemtomolardissociationconstants.ProcNatlAcadSciUSA1998;95:2812-7.[8]LiuQSD,GhiaraJB,BarbasCFIII.Designofpolydactylzincfingerproteinsforuniqueaddressingwithincomplexgenomes.ProcNatlAcadSciUSA1997;94:5525-30.[9]ChandrasegaranSSJ.Chimaericrestrictionenzymes:whatisnext?BiolChem1999;380:841-8.[10]BushmanFDMM.Tetheringhumanimmunodeficiencyvirustype1preintegrationcomplexestotargetDNApromotesintegrationatnearbysites.JVirol1997;71:458-64.[11]XuGL，BestorTH.Cytosinemethylationtargetedtopredeterminedsequences.NatGenet1997;17(4):376-8.[12]NardettiJ，GibsonT，CharnayP.Zincfinger-DNArecognition:analysisofbasespecificitybysite-directedmutagenesis.NucleicAcidsRes1992;20(16):4137-44.[13]CorbiN，LibriV，FanciulliMetal.Bindingpropertiesoftheartificialzincfingercodinggenesint1.BiochemBiophysResComlnua1998;283(3):686-92.[14]ChristyBA，LauLF，NathansD.Ageneactivatedinmouse3T3cellsbyserumgrowthfactorsencodesproteinwith"zincfinger"sequences.ProcNatlAcadSciUSA1988;6(21):7857-61.[15]BeerliRR，BarbasCFIII.Engineeringpolydactylzinc-fingertranscriptionfactors.NatBiotechnol2002;20(2):135-41.[16]SegalDJ，BarbasCFIII.Designofnovelsequence-specificDNAbindingproteins.CurrOpinChemBiol2000;4(1):34-9.[17]ChooY,IsalanM.Advancesinzincfingerengineering.CurrOpinStrnctBiol2000;10(4):411-6.[18]GreismanHA,PaboCO.Ageneralstrategyforselectinghighaffinityzincfingerproteins-88- 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