猪喉软骨硫酸软骨素的制备和抗氧化、降血脂机理研究

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1、中文摘要硫酸软骨素(chs)是来源于动物的一类重要的糖胺聚糖，具有抗炎、抗癌、降血脂和抗氧化等功能。以往主要是通过氢氧化钠．胰酶复合工艺来制备。本试验选择木瓜蛋白酶单酶酶解工艺来提取ChS，对其进行分离纯化和结构分析，研究ChS体外抗氧化特性，并以高脂日粮大鼠为试验动物，研究其抗氧化和降血脂机理。分别用木瓜蛋白酶和氢氧化钠一胰酶酶解工艺提取ChS，用三氯乙酸、DEAE．SepharoseFastFlow离子交换柱层析和SephacrylS-300HR凝胶柱层析进行分离纯化。初步比较了两种方法提取的ChS的基本特征。结果显示木瓜蛋白酶提取的ChS产

2、品色泽洁白，平均相对分子质量43569，分布系数为2．04，工艺简单，提取率30．51士0．89％，重复性好，传统工艺氢氧化钠．胰酶提取的ChS产品色泽深，平均相对分子质量25773，分布系数为3．15，工艺复杂，提取时间长，提取率21．234-1．65％。通过单因素实验和正交实验，确定了木瓜蛋白酶提取ChS的最佳工艺：温度60℃，pH值6．0，木瓜蛋白酶浓度为0．7％，提取时间7h。DEAE．SepharoseFastFlow离子交换柱层析和SephacrylS．300HR分离纯化的ChS经琼脂糖凝胶电泳和高效凝胶排阻柱色谱鉴定为高纯度的均一性

3、大分子。采用脂质体过氧化体系、比色法和化学发光法研究ChS的体外抗氧化作用。结果显示两种方式提取的ChS对超氧阴离子自由基(02一·)和羟基自由基(·0岣具有明显的清除作用，其中木瓜蛋白酶提取ChS的02一·和·OH清除效果好于氢氧化钠．胰酶提取Chs，对于02。，两者的半数抑制浓度(晒D)分别为(O．9士o．09)和(2．9士0．11)mg·mL"1(p

4、有显著作用。接着将ChS进行羧基还原、脱硫和多硫酸化化学修饰，初步探讨ChS是否与铜离子发生配合作用、是否与02一·之间发生相互作用，同时利用生物化学发光，平衡透析、荧光分析、红外光谱和热分析等技术探讨ChS修饰前后的体外·OH和02一-清除特性，探讨发生反应的可能基团。结果显示ChS经碳二亚胺和氯磺酸分别还原和多硫酸化后，都没有显示出·OH清除活性，未经修饰的ChS和脱硫后的ChS清除-OH的坞D分别为(8．904-0．16)mg·mUl和(5．654-0．31)mg·mL"1。ChS在去离子水中具有铜离子配合作用，在酸性介质中配合作用消失，在

5、一定浓度范围内，ChS对Cu”的配合作用随浓度的升高而升高，脱硫后的ChS对Ca2+的配合作用极显著高于未经修饰的ChS，但是经羧基还原和多硫酸化后的ChS对Cu2+的配合作用都极显著低于未经修饰的ChS。ChS与铜形成配合物后，光谱学特征和热稳定性明显改变，乙酰基的红外特征吸收频率在反应前后未改变，说明其没有参与配位反应，而羧基相反，结合荧光淬灭实验，初步认为是羧基而不是硫酸基与Cuz+发生配合作用，阻断·OH的产生；脱硫和还原后的ChS对02一·清除活性极显著低于未经修饰的ChS，硫酸酯化后的ChS产品的02一-清除活性强于未经过修饰的ChS

6、，但差异不显著(p>o．05)。ChS与02一·反应后，红外分析显示归属于羧基和硫酸基伸缩振江南大学博士学位论文动的吸收峰(1418．21L'rfI"1和1230cm4)明显减弱，硫酸基轴向振动吸收峰(855gm4)消失，并且出现两个新的吸收峰(1451．52cm“和869．48cm。)；ChS与02一·反应后，热稳定性明显改变，ChS在244．95"(2．250．166℃发生分解，为放热反应。反应后ChS放热峰消失，在122．483"C．128．76"C和172．10℃．199．36℃范围出现两个吸热峰，证实了ChS的羧基和硫酸基确实与02一·

7、发生了化学反应。采用灌胃法探讨ChS对高脂日粮大鼠的抗氧化作用。24只大鼠适应环境后，根据空腹称重随机分为正常对照组(NC，正常饲料)，高脂模型组(HFD，高脂饲料)，ChS添加组1(Resl，500mg·kg-l·d-1)和ChS添加组2(Res2，1000mg·k百‘-d-1)，连续灌胃5周后测定血清和肝脏中MDA、T-AOC、SOD、GSH、CAT、CP、MPO活性、·OH抑制能力和线粒体DNA氧化损伤程度。结果显示：尽管高剂量组ChS没有比低剂量组ChS有更明显的抗氧化作用，但两组ChS组都能显著升高T-AOC和降低MDA含量，降低高脂日

8、粮大鼠氧化应激；显著升高高脂日粮大鼠血清和组织中的内源性抗氧化剂SOD、GSH、CAT和CP的活性；增强血清和肝脏的羟基自由基抑制能力；