骨髓间充质干细胞静脉移植对脑梗死大鼠治疗作用的研究

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1、中文摘要骨髓间充质干细胞静脉移植对脑梗死大鼠治疗作用的研究摘要目的：大鼠骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs)体外分离、培养、扩增；B．巯基乙醇体外诱导其向神经组织分化，电镜及免疫细胞化学染色法鉴定分化细胞方向；Longa改良线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)模型，观察第4代骨髓间充质干细胞静脉移植对成模大鼠的治疗效果；明确骨髓间充质干细胞是否可经血液循环归巢至受损脑区；是否可在脑内存活、迁移、并

2、向神经组织分化；是否促进神经生长因子(Nervegrowthfactor，NGF)、脑源性神经生长因子(Brain．drivedneurotrophicfactor，BDNF)、血管内皮细胞生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的分泌；是否减少脑缺血半暗带区细胞凋亡。以此探讨BMSCs的生物学特性及静脉移植治疗大鼠脑梗死的效果和机制。方法：1取3～4周龄的健康雄性SD大鼠，采用percoll密度梯度离心法结合贴壁法分离培养BMSCs，传代扩增，取第4代细胞进行诱导分化，

3、倒置相差显微镜下进行形态学观察。2按照Woodbury方案进行预诱导和诱导。L．DMEM培养基+lmmol／LB．巯基乙醇+20％FBS预诱导24小时后，L．DMEM+5mmol／LB．巯基乙醇诱导5小时，之后去除诱导中文摘要液为常规培养基，再培养2周。‘3诱导后进行细胞鉴定：倒置相差显微镜下观测细胞形态学变化；透射电镜观察细胞超微结构的改变；免疫细胞化学染色法对诱导细胞进行神经前体细胞表面标志(神经上皮巢蛋白nestin)、神经元细胞表面标志(神经元特异性烯醇化酶neuronspecificenolase，NSE

4、)、神经胶质细胞表面标志(胶质纤维酸性蛋白glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)的鉴定。4第3代BMSCs传代、换液后进行Brdu标记，时间大约3天，待第4代细胞长满瓶底时收集细胞，待移植。5健康雄性成年SD大鼠(3月龄，体重270．3009)，Longa改良线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)模型。取成模大鼠50只随机分成两组，BMSCs移植组和PBS对照组，每组25只。6于MCAO24h后，将Brdu标记的第4代B

5、MSCs细胞lmL(含3x106个细胞)从尾静脉植入BMSCs组大鼠，对照组同样途径给予等量PBS。于MCAO后1天(移植前)、移植后7、14、21天各组大鼠分别进行改良神经功能缺损评分(modifiedNeurologicalSeverityScores，mNSS)；移植术后7天，各组大鼠分别随机取5只进行TTC染色测定梗死体积；再于同一天和第14、21、28天两组各处死大鼠5只，灌注取脑，多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作石蜡切片。分别行HE染色观察脑缺血病理改变；TUNEL染色观察细胞凋亡

6、；免疫组织化学染色鉴定移植入脑的BMSCs及分化以及NGF、BDNF、VEGF等因子的分泌。7统计学处理中文摘要实验数据建立EXCEL数据库，资料采用SPSSll．5统计分析软件进行数据处理。两组间同一时间点样本均数采用两独立样本t检验，同一组内不同时间点组间均数之间采用单因素方差分析。所有数据以均数±标准差(i土S)表示，以P

7、态。传代后，细胞形态逐渐纯化，至第4代，形态单一，呈长梭形，漩涡状和平行排列生长。2预诱导后细胞形态无明显变化，加入诱导液后细胞形态迅速改变，诱导5小时部分细胞漂浮、崩解、死亡，细胞形态不再发生明显改变，大部分细胞呈现神经元样形态。之后用常规培养基替换诱导液，一周以后，大多数细胞仍为神经元样形态，第2周细胞形态缓慢改变，2周时，细胞形态逐渐回到诱导前扁平的梭形状态。3诱导后细胞神经标志物的免疫细胞化学检测显示：空白对照组Nestin、NSE、GFAP均无表达。其余组，GFAP均为阴性。预诱导组Nestin阳性细胞表

8、达，Nestin阳性细胞数在诱导1h后达到高峰，约为29．35％，诱导5h时几乎测不到。NSE阳性细胞率随诱导时间延长逐渐提高，诱导5h时NSE的阳性率约为57．53％。Nestin、NSE两个指标预诱导24h，诱导1h，诱导5h三个时间点阳性细胞率比较均有统计学意义(P