肺炎衣原体感染的诊断与其应用

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1、论文独创性声明本论文是我个人在导师指导F进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示的谢意。作者签名!塑塑论文使用授权声明13期：M稠一、本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：聋盟导师签名：盟B甄、w刁磊。r复旦大学硕士学位论文摘要肺炎衣原

2、体(Chlamydiapneumoniae，Cpn)作为衣原体属的一种重要的呼吸道病原微生物，自从上个世纪80年代中期正式命名以来得到了研究者们的广泛重视。所致疾病最常见的是肺炎和支气管炎，近年来诸多研究表明其与动脉粥样硬化综合症，老年痴呆症等疾病有关。Cpn分布极其广泛，大约有50．80％的成人血清可检出抗体。在我国，与Cpn感染相关的疾病发生率呈逐年上升趋势。目前检测Cpn的多种方法均存在一定的不足之处。因此，我们试通过制备针对Cpn的单克隆抗体(Monoclonalantibody，McAb)，建立直接免疫荧光法(DirectImmunofluoresc

3、enceAssay，DIF)，同时应用巢式聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)与核酸杂交(SouthernBlotting)方法，检测人外周血单核细胞(PeripheralBloodMononuclcarCell，PBMC)中Cpn抗原和核酸。通过对以上检测结果的比较，较客观的评定每种方法的特异性和敏感性，以便用于辅助Cpn感染的临床诊断，分析Cpn感染与疾病的因果关系。论文第一部分主要内容是，以进口Cpn抗原免疫BALB／C小鼠，将免疫的小鼠脾脏细胞与SP2／O细胞融合，并用间接酶联免疫吸附法(Enzyme-LinkedIm

4、munoadSorbentAssay，ELISA)筛选抗体阳性杂交瘤细胞。结果发现小鼠脾脏细胞与SP2／0细胞的融合率为61．46％(236／384)。经克隆化及筛选后，最终获得4株稳定分泌CpnMeAb的细胞株。杂交瘤细胞接种小鼠后，收集小鼠腹水MeAb，经纯化后用间接ELISA检测抗体效价，效价高者可达1：106；免疫琼脂扩散试验鉴定MeAb为IgG类；微量荧光免疫试验(Micro．immunofluorescenceAssay,MIF)检测McAb种属特异性发现，与鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci，Cps)出现一定程度的交叉反应，而与沙眼

5、衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)则无交叉反应，此结果与进口CpnMeAb一致。Dot-ELISA显示获得的单抗与39．5KD克隆表达的重组Cpn主要外膜蛋白(MajorOuterMembraneProtein,MOMP)呈阳性结合反应，为CpnMOMP特异性MeAb。论文第二部分是以FITC自行标记自制CpnMcAb，其荧光素与蛋白的比值if／P)为2．28，成功获得荧光素标记的McAb。用自制ClanMeAb与进口ClmMcAb，建立了直接免疫荧光法(DIF)。用DIF同时检测240份PBMC标本的Cpn抗原，并进行统计处理。结果显示

6、，两种McAb检测结果均阳性的共86份，SPSS软件分析自制ClanMcAb的特异性和敏感性均与进口McAb具有中等一致性。可用自制MeAb替代进口McAb检测Cpn抗原，以辅助Cpn感染的临床诊断。与进口McAb相比，自制MeAb同样具有敏感性和特异性，且有方便、价廉的特点。以fl$0CpnMcAb对动脉粥样硬化等心血管疾病和某些呼吸道疾病组标本作Cpn抗原检测，阳性检出率分别为69．34％(95／137)和72．06％(49／68)，2复旦大学硕士学位论文分别与正常对照组进行比较，统计结果证实均具显著性差异。提示对于动脉粥样硬化等某些疾病的发生和发展，Cp

7、n感染可能是重要的原因之一，但其中的因果关系还有待深入研究。论文第三部分通过设计Cpn特异性双引物，建立了巢式PCR检测方法，并对该方法进行了相关评价，发现具有很好的特异性和敏感性。在对240份PBMC标本进行核酸扩增检测中，呈阳性的有74．17％(178／240)，比DIF的阳性检出率略高，但并无统计学意义。其中，呼吸道疾病PBMC标本中，巢式PCR的阳性检出率为79．41％(54／68)，心血管疾病PBMC标本的则为75．18％(103／137)。通过Oligo6．0软件设计针对巢式PCR第二步扩增产物，设计特异性DIG标记探针，建立了核酸杂交(South

8、ernBlotting)试验，对24份