长春花萜类吲哚生物碱合成途径中关键酶基因的克隆、表达

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1、摘要本文以长春花(Catharamhusroseld$m．KiDorL)植物幼苗为材料，利用Crateway克隆技术对其萜类吲哚生物碱(Terpeneindolealkaloids，TIAs)生物合成途径中编码关键酶的基因进行大规模克隆，获得相关基因的入门克隆和表达克隆，制备相应的抗体。并对这些基因的mRNA表达水平进行检测。所得结果如下：1．以长春花植物幼苗中提取的总RNA为模板，反转录生成cDNA，经两步Gateway-PcR法获得长春花1IAs类化合物生物合成途径中编码关键酶DXS、DXR、G10H、SLS、TDC、STR和DAT的目的基因(drs、akr、∥

2、Oh、ds、tdc、sir和dat)的全长序列。2．利用Gateway克隆技术通过BP重组反应将目的基因插入到入门载体(pDONR201)中，构建目的基因的入门质粒，筛选出阳性克隆并通过测序验证。3．通过LR重组反应将目的基因从入门载体上转移到表达载体(pETGl0A／20A／30A)，导入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)的感受态细胞中。通过异丙基．9n硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，经SDS-PAGE检测，表明重组的分别含有踟、sls、sir和glOh基因的表达质粒的大肠杆菌菌株均有目的蛋白的表达。4．利用Ni砸D树脂分别对表达量较高的DXR、SLS和STR融

3、合mS标签的蛋白进行纯化，纯化后的蛋白经sDS-PAGE检测没有杂带，用Brad-ford法对纯化后的蛋白进行定量，结果表明所得蛋白已达到制备抗体的要求，目前抗体制备正在进行中。5．对这些基因在长春花幼苗中mRNA表达水平的Northern杂交实验显示dxr、幽、sir和tdc基因在根、茎、叶、花和果实中均有表达，并且从总体上看根和幼叶中的表达量相对高些，老叶中的表达量相对低一些；但是没有检测到目的基因∥Oh、如和dat相应的mRNA杂交信号，原因可能是与所选的植物材料的生长阶段和生长环境有关。关键词长春花；萜类吲哚生物碱：Gateway克隆技术：5-磷酸脱氧木酮糖

4、还原异构酶；次番木鳖苷合成酶；栊牛儿醇一10羟化酶；异胡豆苷合成酶Abstractnlis喊sperformedalargescaleofcloningforgenesencodingkeyenzyrflesinterpeneindolealkaloids(TIAs)pathwayfromCatharanthusrose-l岱皿．)GDon．viaGatewaytechnology．Thesegenes’mRNAexpressionlevelsinCtloseusseedlingswerealsodetected．11地resultsarc越follows：1．ne

5、fulllengthsequencesofdrs，drr,glOh，sls,tdc，sO"anddatwhichencodedkeyenzymesinvolvedinterpenoidindolealkaloidsfrlAslbiosynthesispathway、】l眦obtainedviatwo-stepGatewayPCRmethod．witllthetranscriptedeDNAfromtotalRNAofCatharanthusgosel,lSseedlingsastemplates．2．AfterPCRamplification,theseattB—f

6、lankedDNAfragmentsWCl'einsertedintoattP·containingdonorvector(pDONR201)byBPelonasetogenerateenUyclones,respectively．Positivecloneswe陀screenedfirstbycolonyerackine．PCRandrestrictionenzymeanalysis．andthentheseinsertedgeneswereconfirmedbygenesequencing．3．In0rd盯tOgetprokaryotieexpressionsy

7、stems,ORFsofakr,∥Oh，s／sandst／"havebeenlransfelredtottleirdestinationvectors：pETGIOA,pETG20AandpETG30A,andbeentransformedintocompetentcellsofEcloihosts嘣nBL21(DE3)．SDS·PAGEanalysisresultsindicatedthatthoserecombinantexpressioncloneswhichencodedenzymesofDXR,SLSandSTRw∽overexpressedalter