肌球蛋白轻链激酶n端删除载体的构建

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除r文rfl特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：互垒照签字日期：之!』年』月旦日肌球蛋白轻链激酶N端删除载体的构建研究生：于守鹏指导教师：高颖教授专业名称：生物化学与分子生物学摘要目的：平滑肌在体内分布十分广泛，对维持许多生理功能起着非常重要的作用，其收缩机制

2、非常复杂。肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase，MLCK)在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用，具有激酶活性和非激酶活性。通常认为Ca2+和钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合后，激活肌球蛋白轻链激酶(myosinli曲tchainkinase，MLCK)进而使肌球蛋白20kDa轻链(myosinlightchains，MLC20)19位丝氨酸磷酸化，从而激活肌球蛋白头部的ATP酶活性，使M92+．ATP分解，由此产生的磷酸基结合于横桥使其处于高自由能状态，启动横桥循环，使粗、细肌丝相互滑动，最终导致肌肉收缩。然而

3、，目前对于Ca2+降至静息水平后平滑肌仍维持一定程度的张力以及在无钙／钙调蛋白存在时仍可观察到肌肉收缩的现象难以解释。近年来，关于平滑肌收缩的非钙依赖性调节已成为该领域研究的热点。为研究其形态功能与生物学活性变化，本文拟采用PCR方法删除N端1．41个氨基酸序列(即肌动蛋白结合区域)，构建pCold．MLCKI．41重组质粒，为进一步研究肌动蛋白结合域的结构和功能奠定基础。方法：以构建的重组质粒pCold／155为模板，根据其核苷酸序列设计一含有NdeI酶切位点PCR引物，用DNA聚合酶进行PCR扩增。将扩增片段进行NdeI／EcoRI双酶切，产物行

4、琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因。将目的基因与载体连接，转化至大肠杆菌。筛选阳性克隆，并以此为模板，进行PCR扩增鉴定。对阳性克隆进行测序。结果：1．以重组质粒pCold／155为模板，经PCR扩增后得到～约3．4kb的扩增片段，该片段大小与预期的一致。用NdeI和EcoRI双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳，得到一分子量约3．4kb大小的片段。回收得到MLCK目的基因。2．用NdeI和EcoRI双酶切重组质粒pCold1155，琼脂糖凝胶电泳显示得到约4．4kb载体和约3．5kb的MLCK片段。与预期分子大小一致。回收载体片段。用DNA连接酶将目的基因与载

5、体片段连接，转化至E．coliJMl09。细菌培养过夜，提取质粒，筛选阳性克隆。经测序证实MLCK的N端41个氨基酸序列己被成功删除。结论：在本研究中，成功地将牛胃平滑肌MLCK的N端41个氨基酸序列进行了删除，构建了牛胃平滑肌pCold／155／D41重组载体。本实验为进一步研究平滑肌收缩调节的分子机制提供一定的实验基础。关键词平滑肌收缩肌球蛋白轻链激酶肌球蛋白肌动蛋白CloningofdeletionmutatedN·-terminuscDNAofMyosinLightChainKinaseMasterdegreecandidate：YuShou

6、pengSupervisor：ProfessorGaoYingMajor：BiochemistryandMolecularBiologyAbstractPurposesItiSveryextenswethatthesmoothmuscleiSdistributedincarrying，playaveryimportantroleinmaintainingalotofphysiologicalfunctions，butitscontractionmechanismiSverycomplicated．Thewell．establishedmodefort

7、heregulationofsmoothmusclecontractionis：Ca”formacomplexwithcalmodulin(CaM)，thecomplexactivatesmyosinlightchainkinase(MLCK)tophosphorylate20kDamyosinlightchain(MLC20)atSerl9toactivatemyosinATPaseactivity，andtheinorganicphosphateresultingfromM92+一ATPhydrolyzedbyactivatiedmyosinMg

8、‘+-ATPasebindswithcross．bridgetoincreaseitsGibbsfreeen