timp-3n端结构域重组腺病毒载体的构建与鉴定

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1、南京医科大学硕士学位论文论文独创性声明本论文!兰丛￡：圣盟监结抱垡重堑篮疽壹蜚佳鳗煎瘦生鉴定是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。专业：生塑焦堂生佥壬生堑堂作者签名：盏：圣童墨日期：丞!五皋!么．了仔论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密

2、的论文在解密后遵守此规定。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：聋互j磊导师签名：日期：趟车姐』目^南京医科大学硕士学位论文TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体的构建与鉴定中文摘要目的组织金属蛋白酶抑制因子一3(tissueinhibitorofmetalloproteinase一3，TIMP．3)在胰腺癌的发生和发展中起着重要的作用。但是，TIMP．3N端结构域(N．TIMP3)蛋白对胰腺癌的作用还不清楚。本课题拟构建与鉴定N—TIMP3重组腺病毒载体，为以后深入研究N．TIMP3对胰腺

3、癌的作用奠定基础。另外，还拟构建与鉴定增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)重组腺病毒载体，作为重组腺病毒载体构建过程中的系统阳性对照。方法分别将编码N-TIMP3与EGFP的DNA片段定向克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV，构建重组穿梭质粒pShuttle-N．TIMP3与pShuttle—EGFP。将上述穿梭质粒PmeI线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1进行同源重组，构建重组腺病毒载体pAd-N—TIMP3与pAd-EGFP。分别将PacI线性化的重组腺病毒载体转柒QBI一293A细胞，获得重组腺

4、病毒Ad-N。TIMP3与Ad—EGFP。上述重组腺病毒经过两次感染QBI．293A细胞而扩增后，用半数组织培养感染剂量(tissuecultureinfectiousdose50，TCID50)法检测滴度。最后，将重组腺病毒Ad-N．TIMP3与Ad-EGFP分别感染胰腺癌细胞系PANC．1细胞后，通过Westernblot的方法检测TIMP．3N端结构域蛋白的表达，以及通过荧光倒置显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。2南京医科大学硕士学位论文结果穿梭质粒pSh眦le．N．TIMP3-}5pShuttle—EGFP经过鉴定，被确认成功构建；相应的重组腺病毒载44vpAd-N

5、．TIMP3-与pAd．EGFP经过鉴定，也被确认成功同源重组。将上述重组腺病毒载体分别转染QBI．293A细胞，能够观察到细胞致病变效应(cytopathiceffect，CPE)．重组腺病毒Ad—N-TIMP3与Ad．EGFP经两次扩增后，滴度分别达至I]5x108PFU／ml与8x108PFU／ml。最后，将重组腺病毒Ad-N．TIMP3与Ad．EGFP分别感染胰腺癌细胞系PANC一1细胞，能够检测到目的蛋白的表达。结论本实验成功地构建了复制缺陷型重组腺病毒载44VpAd．N-TIMP3-与pAd．EGFP(后者为系统阳性对照)，并检测到目的蛋白的表达，为以后深入

6、研究N．TIMP3对胰腺癌的作用，以及探讨N．TIMP3转基因治疗胰腺癌的可能性奠定了基础。关键词组织金属蛋白酶抑制因子．3(TIMP．3)N端结构域；增强型绿色荧光蛋白(EGFP)；腺病毒载体3，1·o’‘1‘一‘no‘一‘一LonstructionandidentincationolrecombinantadenoviralplasmidexpressingtheN--terminaldomainofTIMP--3AbstractobjectiveTIM])一3(tissueinhibitorofmetalloproteinase一3)playsanimportan

7、troleinthedevelopmentofpancreaticcancer．However，theeffectofN—TIMP3(N—terminaldomainofTIMP一3)onpancreaticcancerisstillnotclear．TheaimofthisstudywastoconstructandidentifyrecombinantadenoviralplasmidexpressingN—TIMP3，forfurtherinvestigatingtheeffectofN-TIMP3onpancreaticcance