人胰岛素样生长因子-ⅰ基因在巴斯德毕赤酵母中分泌表达

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1、中文摘要人的胰岛素样生&因子一I是存在于人体多种组织中的具有多种重要生理功能的细胞网子。它的缺乏会导致多种严重的疾病。因而它也成为具有多种治疗川途的药物。本研究目的是利州毕赤酵母表j厶系统高教地表达这种蛋白。本研究利_}}JPCR引入突变的方法成功地改造胰岛素样生长困子一l的基因序列以满足毕赤酵母对密码子的偏好性，以期提高其在毕赤酵母表达系统中的表达水平。成功地将改造过的人胰岛素样生妖网子基嘣定向克隆剑毕赤酵母袭达载体上。把构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，经历组氨酸缺陷培养基的筛选和禽有不同浓度G418的培养基的多次筛选，获得9个能在含5．Omg／mlG418YP

2、D培养基上生K克隆。PCR鉴定表明：胰岛素样生长因子I基因已经成功地整合进入毕赤酵母GSll5的基冈组中。挑选其中的1个克隆在恒温振荡器实行诱导表达。分别在第48、72、96、120小时取上清，川硫酸铵沉淀蛋白。经过SDS—PAGE电泳显示：表达的外源蚩白与目标蛋白人小一致。Westernbloting表明它就是我们所要表达的目标蛋白。经测定，96小时的培养I二清中目标蛋白的表达量约为400mg／L，约11i培养上清总蛋白的50％。我什J的r[作为进一步筛选更高表达菌株，活性的测试，以及临床应用打。卜_一定的基础。关键词：人胰岛素样生氏网子一I，毕赤酵母，分泌表达，pP

3、IC9K，6S115AbstractHumaninsulin—likegrowthfactor-1whichliesinmanyhumantissuesisanimportantcellfactorwithmanyimportantphysiologicalfunctions．Theabsenceofthefactorwillcausemanyseriousdeseases．Thusitmaybepharmaconwithmulti-function．ThisreserchaimstoexpresstheproteininhighlevelwitllPichiapast

4、orisexpresssystem．Inthisresearchwesuccesfullychangedthesequenceofinsulin—likegrowthfactor．1genewithPCRtomeetthepastorispichia’sfavoritesoasforachievinghi曲expressinglevelinpichiapastorisexpresssystem．ThechangedgenewasclonedinorientationintopPIC9Kvector．Theconstructedvectorwastransformedin

5、topichiapastoris．AftersecreeninginMDmediumandinYPDmediumwithdifferentconcentrationsG418，nineclonesremaininYPDmediumwith5．0mg／mlG418PCRanalysisoftherecombinantsshowedthatthehumaninsulin·likegrowthfactor．1genehadsuccessfullyintegratedintothepichiapastorisGSI15genome．Oneclonewaspickedtocult

6、uremediumandindueedtoexpresstherecobinantfactor．After48hours、72hours、96hoursand120hourstheculturesupernatantwascollectedandtheammoniumsulfatewasusedtoprecipitatetheproteinintheculturesupematant。SDS—PAGEshowsthatthecuturesupematantcontaintheproteinthatisfamiliarwithouraimedproteininsize．W

7、esternBlottingshowstheproteiniswhatwegofor．Thetargetproteininthe96hours‘culturesupematantisattheconcentrationofabout400mg／Landabout50％oftotalproteinintheculturesupernatant．Ourworkmakesgoodfoundationfurfurtherreserchsuchasproteinactivitytest，screeningrecombinantstrainswith